影響豬精子冷凍保存效果的研究進展

張 涵，王赫川，李天峰，張 群，王 騫，郭銘暉，李雁冰，魏國生，李井春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

隨著我國居民生活水平的提高，豬肉已經(jīng)成為我國乃至世界上需求量最廣泛的肉類。為了滿足人類的需求，就必須專注于用更少的種豬生產(chǎn)更多品質(zhì)優(yōu)異的豬肉。目前精液保存方法主要有常溫、低溫和冷凍保存，常溫保存精液技術(shù)操作簡單，但精液保存時間超過48 h就會品質(zhì)下降，而冷凍保存精液與常溫保存精液相比，具有保存時間長、便于遠距離運輸和成本低等優(yōu)點。豬精液在冷凍-解凍過程中易遭受損傷，造成精子受精能力下降。因此，人們開始不斷探索在精液稀釋液中加入一定量的抗氧化劑、保護劑、抗菌劑等物質(zhì)來改善解凍后豬精子質(zhì)量。加快豬精液冷凍保存技術(shù)的改良研究，有助于推動畜牧業(yè)發(fā)展，提高人民生活品質(zhì)。

1 豬精液冷凍原理及損傷機制

豬精液冷凍主要是指新鮮采集的精液經(jīng)過稀釋等預處理后，利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）作為冷源，通過熏蒸或其他處理方式緩慢降溫，然后在超低溫狀態(tài)下保存，使精子代謝速率降低或處于靜止狀態(tài)，便于長期保存，待解凍后精子仍具有活性和受精能力。

精子在冷凍保存過程中極易受到不同程度的物理損傷、氧化損傷和化學損傷。物理損傷通常指在精液冷凍時因溫度下降過快，細胞內(nèi)液體形成冰晶體從而對精子細胞內(nèi)部及細胞膜造成不可逆損傷。通過控制溫度下降速度可減少冰晶數(shù)量維持微晶狀態(tài)，減少冷凍造成的物理損傷。氧化損傷是精子在冷凍過程中溫度下降過快，精子氧化應激產(chǎn)生過多活性氧，造成膜上不飽和脂肪酸被氧化，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物，打破原本的氧化還原平衡狀態(tài)和精子的完整結(jié)構(gòu)，對精子造成不可恢復的損傷，也是細胞凋亡的重要因素之一。化學損傷是指精液在冷凍過程中，細胞外液最先形成冰晶，導致細胞內(nèi)外滲透壓不平衡，使細胞外液滲透壓大于細胞內(nèi)滲透壓，水分從細胞內(nèi)部流向細胞外液，造成精子脫水死亡。

2 影響豬精液冷凍保存質(zhì)量的因素

2.1 冷凍溫度和速率

降溫處理是精液冷凍保存過程中重要的一步程序，降溫主要指由新鮮采集的精液溫度降低到冷凍保存的溫度。降溫需跨越一個危險溫度區(qū)域，即-5℃至-60℃，溫度的變化會影響精子的代謝功能，也會損害精子的頂體膜，降低膜的通透性，這種影響稱為低溫打擊。低溫打擊對不同動物的精子影響程度不同，豬精子最敏感，牛、羊、馬次之，兔、人和禽類較差。許多研究表明，控制降溫速度可以減少或阻止低溫打擊的發(fā)生。精子細胞內(nèi)冰晶未形成前，細胞外已結(jié)冰被認為是豬精子理想的冷凍效果。冷凍速率的快慢影響了冰晶的數(shù)目和大小，過快、過慢都會對精子造成嚴重的損害。

2.2 添加抗氧化劑

由于精子在冷凍過程中，精子膜上的不飽和脂肪酸會產(chǎn)生活性氧，活性氧的過量產(chǎn)生會導致氧化應激，造成精子線粒體損傷、質(zhì)膜不完整、解凍后活力下降。許多研究為提高精液冷凍質(zhì)量在精液的稀釋液中加入一定的抗氧化劑來降低活性氧的含量，提高精子的存活率，增強豬冷凍精子的效用。

2.2.1 白藜蘆醇

白藜蘆醇是1940年從藜蘆中分離出的多酚類二苯乙烯類化合物，葡萄、花生、虎杖是其主要的天然來源。由于其具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、防治心血管疾病等特性，使得它在食品添加劑、保健、化妝品、醫(yī)藥方面等領(lǐng)域廣泛應用。在雞、豬、人類和水牛的基礎(chǔ)稀釋液中添加白藜蘆醇，其凍精的活力與鮮精差異不顯著。菅芯蕊等應用25、50、100、200 μmol/L濃度的白藜蘆醇對松遼黑豬精液進行冷凍保存，30 d后檢測結(jié)果表明，在精液冷凍前添加50 μmol/L白藜蘆醇效果最好，可改善解凍后的精子質(zhì)量。

2.2.2 蝦青素

蝦青素屬于酮式類胡蘿卜素，是自然界中的一種強抗氧化劑，在真菌和海洋微生物中廣泛分布，通常以游離形式存在。由于其結(jié)構(gòu)式中含有異戊二烯共軛雙鍵、羥基和不飽和酮基，容易和未配對的電子反應，所以能夠有效地清除活性氧，保護脂肪酸免受脂質(zhì)過氧化。Basioura等探討了在豬精液冷凍保存過程中，添加蝦青素對改善低溫保存精子的質(zhì)量和功能狀態(tài)具有的潛在影響，且在解凍稀釋液中添加0.5 μmol/L蝦青素對公豬冷凍精子凋亡變化有微弱的促進作用。胡亞美在對豬精液常溫保存時得出，添加0.25 μg/mL蝦青素能提高精液ATP水平（腺嘌呤核苷三磷酸簡稱三磷酸腺苷，是一種不穩(wěn)定的高能化合物）和乳酸脫氫酶活性，高線粒體膜電位比例增加，對精子的活力和運動參數(shù)都有所提高，但差異不顯著。

2.2.3 蘆丁及其他

蘆丁又稱維生素P，屬于黃酮類化合物，是一種呈淡綠色或淡黃色的粉末，在蕓香葉、棗、杏、番茄中廣泛存在。其具有抗脂質(zhì)氧化、抗自由基、抗病毒等作用。目前蘆丁在豬冷凍精液保存中的研究還是比較少見的。吳林在長白豬的稀釋精液中添加0.6 mmol/L的蘆丁，使解凍后的精子運動能力增強，提高了精子的生理特征，顯著降低了精子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應。此外，在豬的基礎(chǔ)稀釋液中加入合適濃度的γ-谷維素、芝麻酚、綠原酸等抗氧化劑都能有效提高豬冷凍精子的質(zhì)量。

2.3 添加抗菌物質(zhì)

精液從采集、處理和保存中經(jīng)常會被微生物污染，微生物會使精子質(zhì)量下降并縮短精子壽命，受污染嚴重的精液可能會導致母畜發(fā)生子宮內(nèi)膜炎等疾病，在精液稀釋液中適當添加抗菌素可有效防止精子退化和疾病傳播。Feng等結(jié)果表明在17℃液體儲存公豬精液時，在稀釋液中加入0.02 g/L磺胺與對照組相比，葡萄球菌和假單胞菌減少，并且將保存的精液用于人工授精后，母豬產(chǎn)仔數(shù)高于其對照組。

由于使用抗菌素會使部分細菌產(chǎn)生耐藥性，對人類的健康造成了嚴重影響，所以學者們把研究重心放在了抗生素的替代品上。Alberto等研究茶樹（互葉白千層）和迷迭香精油的非殺精濃度在冷藏豬精劑量液相上的抗菌能力時表明：互葉白千層和迷迭香精油，在0.4 mg/ml濃度下，對20%的精漿和80%的豬受精液混合物都能產(chǎn)生與氨芐青霉素相似的效果。抗菌肽PMAP-37被認為是能代替抗生素的候選物質(zhì)之一，它能有效保持精子活力并控制細菌數(shù)量。另外，在豬精液低溫保存技術(shù)中，溫度也能夠影響儲存過程中細菌的傳播，Waberski等證明，低溫儲存5℃，可減少抗菌素的使用。

2.4 冷凍保護劑

冷凍保護劑是豬精液稀釋液中必不可少的組成部分，為了降低精子在冷凍保存過程中所遭受的冷打擊傷害程度，許多學者選擇在稀釋液中添加一定量的冷凍保護劑來確保精液冷凍保存效果。目前，有滲透性和非滲透性兩種冷凍保護劑，它們在冷凍保存過程中均可形成保護玻璃態(tài)，可以保存豬精子生物分子和細胞結(jié)構(gòu)。

2.4.1 滲透性保護劑

滲透性保護劑大多是一些小分子物質(zhì)，主要包括二甲基亞砜、甘油、二甲基甲酰胺、乙二醇等，它們在細胞冷凍懸液凝固之前，透過細胞膜滲透到細胞內(nèi)部，使細胞內(nèi)外溶液產(chǎn)生濃度差，而精子細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度降低，避免精子細胞脫水皺縮引起的損傷。但滲透性冷凍保護劑對精子而言，尤其是在高濃度情況下具有一定的毒害作用。目前豬精液冷凍保護劑中使用最常見的是甘油，其結(jié)構(gòu)中的3個羥基可結(jié)合精液中的水分，使水分子形成冰晶得到控制，其烴鏈屬于疏水基團，通過阻礙精子內(nèi)水分滲透來保護精子免受損傷。Yang等研究不同濃度的甘油（0%，1%，2%，3%和5%）和二甲基乙酰胺（DMA：0%，1%，3%和5%）對豬精液冷凍后精子質(zhì)量的影響得出，精液中含有5%的甘油的干冰冷凍精液組，解凍后精子活力、活率和頂體完整率優(yōu)于其他組合，但含有3%甘油的干冰冷凍精液組，解凍后的精液質(zhì)量指標效果最好；甘油和DMA聯(lián)合使用和其他組相比，對提高冷凍存活率影響不大。但一些研究結(jié)果顯示，稀釋液加入甘油的濃度較高時，對精子產(chǎn)生毒害作用，降低受孕率，破壞精子的核膜。Pinho等在評估不同保護劑對Piau豬精液冷凍的可行性時，得出單獨使用酰胺（3%）和甘油（2%）或與二甲基乙酰胺（5%）的組合比單獨使用甘油對冷凍保護更有效。

2.4.2 非滲透性保護劑

非滲透性保護劑大多是一些大分子物質(zhì)，主要包括卵黃、脫脂乳、羥乙基淀粉、海藻糖、白蛋白等，它們對精子不會產(chǎn)生毒性，主要通過調(diào)節(jié)精子細胞外液滲透壓來控制細胞內(nèi)冰晶的形成，從而保護精子免受損傷。近年來，非滲透性保護劑使用最廣泛的是卵黃。卵黃中的膽固醇能夠保持精子活力，卵黃中的脂質(zhì)蛋白、卵磷脂類物質(zhì)可防止精子遭受冷打擊。汪俊躍等研究豬精子冷凍保存凋亡時，以高壓均質(zhì)蛋黃+Tris-檸檬酸-葡萄糖（TCG）稀釋劑為處理組和普通蛋黃+三檸檬酸-葡萄糖（TCG）稀釋劑為對照組，比較得出以高壓均質(zhì)蛋黃處理的精液，解凍后精子活力、活率、DNA完整率、線粒體膜電位和頂體完整率均優(yōu)于對照組，推測高壓后的蛋黃中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)能更好地融合，降低了卵黃自身帶有的微生物對冷凍后精液的影響，而Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性明顯低于對照組，降低了在豬精液冷凍細胞的凋亡水平。鐘觀新對廣東小耳花豬精液冷凍保存時發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中加入新鮮雞蛋卵黃比陳舊雞蛋卵黃效果好。

2.5 解凍溫度和時間

豬精液在解凍過程中也需要跨過-25～-5℃的解凍危險區(qū)，并且解凍速率過慢會導致豬精子內(nèi)部發(fā)生重結(jié)晶，與解凍液接觸時間過長也會使精子遭受破壞；解凍速率過快會損害質(zhì)膜完整性或出現(xiàn)沒完全解凍的現(xiàn)象。因此，合適的解凍溫度和速度對豬精子解凍至關(guān)重要。冷凍保存的豬精液目前有低溫冰水解凍（0～5℃）、溫水解凍（30～40℃）、高溫解凍（50～70℃）等解凍方式。目前主要采用從液氮罐中取出豬冷凍精液的細管后，快速放入50℃的水浴鍋中解凍10 s的方法解凍。Tomás等評估表明凍精在70℃解凍8 s時公豬精子活力和曲線速度、直線速度、平均路徑和頭部平均側(cè)向位移幅度均高于凍精在37℃解凍20 s時觀察的結(jié)果。凌培鳳研究結(jié)果表明37℃解凍30 s和65 ℃解凍5 s是豬冷凍精液的最佳解凍溫度。

3 小結(jié)

豬精液冷凍技術(shù)的發(fā)展充分利用了優(yōu)秀的種豬資源，克服了地域間差異引起的不便，為養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展提供了巨大幫助。目前，冷凍保存技術(shù)在抗氧化劑、抗菌物質(zhì)、冷凍保護劑等方面研究取得一定進展，但豬冷凍精液因解凍后效果不佳，經(jīng)濟成本較高等問題，在實際生產(chǎn)中的實踐應用還需進一步研究與探討。