肺泡灌洗液病原微生物宏基因組測序對兒童遷延性肺炎的診斷價值

謝向鋅 黃偉萍 潘強 屈翔 勞金泉

兒童遷延性肺炎多由支氣管肺炎遷延不愈演變而來，是以咳嗽、咳痰、氣促、呼吸困難等肺炎癥狀及體征持續1至3個月為主要表現。病原尚未明確無法針對性治療是病情遷延的重要原因。本院兒科在2019年6月至2021年6月對46例兒童遷延性肺炎患者，開展電子支氣管鏡檢查，收集所有患兒的肺泡灌洗液進行病原微生物宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing，mNGS），傳統病原微生物灌洗液細菌培養等，并進行比較分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2019年6月至2021年6月廣西醫科大學第四附屬醫院（柳州市工人醫院）兒科住院患兒，符合兒童遷延性肺炎的診斷標準［1］患兒共46例，其中男24例，女22例；年齡最大11歲，最小2歲，（6.15±1.32）歲。（1）納入標準：①符合兒童遷延性肺炎的診斷標準，經肺部X線或CT檢查進一步明確診斷；②有電子支氣管鏡檢查及肺泡灌洗適應證；③本次病程未進行病原學檢查。（2）排除標準：①已明確診斷為哮喘、支氣管擴張以及已有肺炎并發癥的患兒；②嚴重肝、腎、心功能異常的患兒。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有家屬均簽署同意行電子支氣管鏡檢查及肺泡洗液mNGS檢測、傳統的病原微生物學抗體檢查及灌洗液細菌培養等相關操作與檢測。

1.2 標本留取 所有患兒入院后行電子支氣管鏡檢查，進行肺泡灌洗術，留取肺泡灌洗液10～20 mL分別進行病原微生物mNGS檢測、傳統的病原微生物學病原學培養［2］。肺泡灌洗液按《下呼吸道感染細菌培養操作指南》進行細菌培養分離，普通細菌培養采用血平板培養基、麥康凱培養基、巧克力培養基，真菌培養采用沙保羅培養基進行病原體分離培養。mNGS標本外送第三方基因檢測公司（微遠基因）作病原學檢測，mNGS標本的采集、保存和運輸過程嚴格按照該公司標準化規范執行。

1.3 觀察指標 以檢測出病原體為陽性，觀察肺泡灌洗液病原微生物mNGS與傳統的病原微生物檢查方法所得病原菌的陽性率及差別，觀察檢測前抗菌藥物的使用對兩種檢測方法結果陽性率的影響。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。應用四格表計算傳統微生物培養和mNGS的靈敏性、特異性；病原學mNGS檢測與傳統病原學培養結果，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病原學檢測結果 本次送檢的46例標本中，通過mNGS檢測出病原體41例，檢測陽性率為89.1%，其中單一病原體感染34例：其中檢出病毒4例，支原體2例，流感嗜血桿菌4例，副流感嗜血桿菌1例，銅綠假單胞菌2例，肺炎鏈球菌8例，屎腸球菌1例，大腸桿菌1例，曲霉菌2例，結核分枝桿菌1例，鮑曼不動桿菌3例，其他定植菌5例；混合感染7例：副流感嗜血桿菌+卡氏肺蟲孢子1例，流感嗜血桿菌+病毒1例，鮑曼不動桿菌+肺炎鏈球菌1例，支原體+病毒1例等，陰性結果5例。采用傳統肺泡灌洗液進行病原學培養，檢測出陽性21例，陽性率為45.7%，其中病毒2例，支原體1例，流感嗜血桿菌4例，副流感嗜血桿菌1例，銅綠假單胞菌2例，肺炎鏈球菌6例，鮑曼不動桿菌1例，嗜麥芽窄食單胞菌1例，葡萄球菌屬2例，肺炎支原體1例。

2.2 mNGS檢測結果 傳統病原學培養陽性的21病例中，mNGS結果均為陽性，傳統病原學陰性的病例中，mNGS結果陽性為20例，mNGS結果陰性病例5例。以傳統病原學檢測結果為金標準，發現mNGS檢測技術兒童遷延性肺炎病因的病原學診斷中的靈敏性為100%，特異性為20%，準確性為56.52%。

2.3 抗生素的使用對兩種方法結果檢出率的影響 46例患兒中有40例在檢測前使用抗生素（檢測前均使用抗生素超過3 d）。在40例檢測前已經使用抗生素的病例中，mNGS檢測的陽性率為87.5%，而傳統檢測方法的陽性率為47.5%，mNGS檢測的陽性率明顯高于傳統方法，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

兒童遷延性肺炎多病因診斷較為重要，臨床病原學常規方法有鏡檢、培養、抗原/抗體檢測和核酸檢測。依賴傳統方法則部分感染性疾病病原體不能明確診斷，所以理想的病原學檢測方法成為研究熱點。二代測序技術（next generation sequencing，NGS）是相對于一代測序技術而言的新型測序方法。mNGS技術是指采用NGS技術對特定標本中所有核酸序列進行測序，它對病原學的診斷具有無偏移、全覆蓋、高靈敏度、準確性高的特點，目前已經被廣泛應用于臨床各個領域，如用于快速檢測各系統感染性疾病的病原微生物如膿毒血癥［3-4］、中樞神經系統感染［5-7］、消化系統感染［8］、呼吸系統感染及爆發性感染［9］。與傳統病原體培養相比，病原 mNGS 檢測能敏感識別不同類病原體［10-12］，尤其在細菌感染合并真菌、病毒、支原體、衣原體等感染時更具顯著意義。本研究結果顯示，mNGS檢測可使陽性率從傳統培養的 45.7%（21/46）增高至89.1%（41/46）；與傳統培養比較，mNGS技術可檢測出的陽性病原體增加了9種細菌、2種真菌、4種病毒。以傳統病原學檢測結果為金標準，研究發現mNGS檢測技術兒童遷延性肺炎病因的病原學診斷中的靈敏性為100%，準確性為56.52%，提示 mNGS 對病原體檢測較傳統培養敏感性更高，可以幫助感染患者明確診斷，細菌、病毒等感染患者可表現出相似的臨床癥狀，針對病因進行正確干預，對指導抗感染的藥物合理使用具有積極作用。本研究發現在檢測前已使用抗菌藥物的病例中，mNGS檢測方法的陽性率較傳統方法明顯升高，提示mNGS檢測方法檢測結果受抗菌藥物暴露的影響較小，有助于指導臨床合理用藥。

綜上所述，肺泡灌洗液mNGS檢測的結果受抗菌藥物暴露的影響小，且在兒童遷延性肺炎病原檢測敏感、診斷準確，可提高兒童遷延性肺炎的病原學診斷率，值得在臨床推廣。因此，對于兒童遷延性肺炎，病原體尚未明確，多次反復住院的患兒，或傳統培養方法陰性且治療效果不理想的，疑有特殊病原體感染的或者提示可能有傳染性的感染等情況，為獲得真實可靠的病原學資料，可選擇電子支氣管鏡下對肺泡灌洗液進行mNGS檢查，盡早完善病原學檢查，選擇合適的藥物治療，避免病情遷延，在感染性疾病病原學診斷中顯示出巨大的臨床應用價值，但仍存在一些問題，如它無法提供相應的藥敏結果，且檢測費用較高。故可根據臨床需要，進行合理檢查，以取得較好的治療效果。