單克隆抗體技術在畜禽疾病診斷中的應用

吳芷靜

（遼寧省沈陽市沈北新區農業技術推廣與行政執法中心 110000）

1975 年，Kohler 和Milstein 通過細胞雜交技術，利用綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，建立起第一個B細胞雜交瘤株，并成功制備出抗綿羊紅細胞的單克隆抗體，由此發現了可產生抗體的雜交瘤細胞。他們發現，雜交瘤細胞具有單一的特異性抗原識別位點，具有小鼠淋巴細胞的特性和骨髓瘤細胞持續增殖的能力[1]。單克隆抗體的識別性專一，只針對特定的抗原決定簇反應，大大提高了敏感性。雜交瘤細胞表達的是針對淋巴細胞的特異性抗體，以及其在組織培養中生長的骨髓瘤細胞的永生特征。重要的是，雜交瘤是單克隆的，因為培養的細胞起源于一個細胞。雜交瘤細胞可注射到組織相容性小鼠體內產生腹水細胞腫瘤，此方法成為高濃度單克隆抗體的來源，通過此方法產生的單克隆抗體可以在液氮中無限期冷凍，需要細胞時可以隨時解凍并重新培養，繼續生產相同的特異性抗體，產生的特異性抗體不會因批號不同產生差異，有利于診斷試劑標準化，也便于制備試劑盒。相對于其他生物學診斷方法，畜禽疾病診斷中單克隆抗體診斷技術具有更加特異、靈敏、成本更低的優點，而且隨著生物技術手段的提高，單克隆抗體更易于生產出商品化的診斷試劑，目前膠體金試紙條的應用使得畜禽疾病診斷更加快速便捷。因此，單克隆抗體診斷方法具有廣泛的應用前景[2]。

1 單克隆抗體的一般應用

單克隆抗體在生物醫學領域一般用于鑒定蛋白質、碳水化合物和核酸等大分子物質。如今單克隆抗體可以用于細胞復制和分化領域，大大提高了我們對分子結構和功能之間的了解，在基礎生物科學方面，提高了我們對宿主抵抗傳染病和器官移植排斥反應的認識，同時也提高了人們對自發轉化的細胞（腫瘤）及內源性抗原（參與自身免疫）的認識。

在獸醫學中，單克隆抗體主要應用于3 個方面，即（1）免疫診斷試劑，直接作為證明病原體或間接用作血清學抗原致病因子的檢測；（2）用于抗原表位的分子解析及疫苗的單克隆抗體的保護性免疫實驗；（3）用于傳染性疾病的免疫治療方面或可作為定位和靶向腫瘤的工具[2]。

2 單克隆抗體在家畜疾病診斷中的應用

2.1 使用單克隆抗體診斷微生物疾病

布魯氏菌病（布病）是由布魯氏菌引起的以發熱和流產為特征的人獸共患病，威脅著人類和多種動物的生命安全，對畜牧業造成巨大的經濟損失[3]。牛布魯氏菌病會導致懷孕后期的母牛流產，飲用感染牛乳汁的人群會感染該病。接種過疫苗的奶牛可能被診斷為布病是因為常規診斷方法無法區分病原微生物和由致病微生物制成的疫苗。單克隆抗體診斷法能高效、特異的檢測出感染和免疫動物，使用該法可在發生疫情時快速隔離感染動物，減緩疫情的蔓延。單克隆抗體作為免疫組化法的抗體可以鑒別牛布魯氏菌脂多糖表位：光滑菌株的A 和M 表位、粗糙菌株的R1 和R2 表位[4]。如今競爭ELISA 抗體檢測法是一種成熟穩定的檢測方法。將布氏菌抗原固定在酶標板后，待測血清和針對抗原表位的單克隆抗體進行共培養，當待檢樣品沒有結合其他抗體時才能檢測到單克隆抗體與酶標記抗原的結合，極大地提高檢測效率。

副結核病（MAP）又稱約內氏病，是一種由副結核分枝桿菌引起的以慢性增生性腸炎為特征的傳染性疾病。副結核病給畜牧業造成了巨大的經濟損失[5]。目前已產生對副結核桿菌分泌的重要蛋白即Ag85 復合物高度特異的單克隆抗體，單克隆抗體法與ELISA 法、糞便檢查法相比具有較高的靈敏度和特異性，基于此法建立了血清庫，可以快捷的區分MAP 陽性牛和陰性牛。

鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體所引起的一種急性全身性感染性疾病，鼠類和豬是兩大主要傳染源，畜禽出現流產、死胎、不孕及產奶量減少等癥狀。目前已經報道了命名為M553 的鼠單克隆抗體，M553 單克隆抗體可與伯氏鉤端螺旋體等螺旋體的表位共同抗原結合。與顯微凝集試驗(Matt) 相比，單抗-競爭ELISA 抗體檢測法（cELISA）具有更好的應用價值[6]。

牛傳染性胸膜肺炎（CBPP）是由絲狀支原體引起的牛的一種高度接觸性傳染性疾病。Ayling 等(1998) 發現了M92/20單抗的間接免疫組化法(IHC) 診斷疑似感染CBPP 的病例的方法[7]。使用間接免疫組化法檢查11 只感染CBPP 的牛肺，能檢測到所有感染病例。這表明M 92/20 單抗的間接免疫組化檢測法具有高靈敏度。

2.2 用于檢測抗禽流感病毒的抗體

目前急需加強病毒感染診斷研究，建立國際病毒基礎數據庫，方便診斷和遏制病毒性疾病在全球的蔓延。在病毒感染檢測方面，單克隆抗體的診斷發揮了關鍵作用。

口蹄疫（FMD）是豬、牛、羊等主要家畜和野生偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，并被世界動物衛生組織（OIE）列為A 類傳染病之首[8]。被公認為是十六世紀以來威脅養牛業的重大疾病之一，在印度，每年約有5000 起疫情，對養殖業造成巨大的經濟損失。因此，采用單克隆抗體高效快速診斷口蹄疫疫情可以減少畜牧業損失。單克隆抗體的流行診斷裝置（LFD）對7 種FMDV 血清型反應，能快速診斷不同血清型的口蹄疫，為早期實施控制措施預留時間，減少FMD 的快速傳播。在目前臨床診斷上，針對FMD 已開發出快速色譜條測試。另外，臨床上還開發了基于單克隆抗體技術的膠體金免疫層析試紙條檢測方法，試紙法可以在野外簡單快速地檢測A 型口蹄疫病毒，具有較高的靈敏度和特異性[9]。

牛傳染性鼻氣管炎（IBR）是由牛皰疹病毒1（BoHV-1）引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病。該病以高熱、呼吸困難、鼻炎、竇炎和上呼吸道炎癥為特征[10]。通過BoHV-1單克隆抗體中和病毒上清液可以用于鑒定牛傳染性鼻氣管炎。

藍舌病毒（BTV）屬于呼腸弧病毒科中環狀病毒，目前已被廣泛研究。從病毒血清分組看，存在于BTV 病毒核衣殼外層的VP2 蛋白質參與病毒復制，是藍舌病毒重要的組成部分。目前已經生產了幾種單克隆抗體來鑒定VP2 蛋白上的特異性表位[11]。此外，存在少量病毒外層中的VP7 蛋白可從病毒外表面獲得，并且可靶向檢測BTV。

狂犬病是一種是由狂犬病病毒引起的、影響溫血動物的急性病毒性腦脊髓炎。盡管狂犬病病毒糖蛋白上抗原位點的數量隨時間推移而有規律的增加，早期試驗可以根據中和抗性變異狂犬病毒的分組確定至少3 個功能獨立的抗原位點。但Benmansour[12]等通過使用250 多個新分離的單克隆抗體對H-2d 單體型小鼠中蛋白質抗原性進行了特異性檢測。

2.3 用于診斷寄生蟲病

旋毛蟲病是在動物與人之間傳播的人獸共患病[13]。單克隆抗體在旋毛蟲病早期診斷中極具意義，基于IgY（蛋黃免疫球蛋白）和針對排泄分泌抗原（IgM 型）的抗旋毛蟲肌幼蟲的單抗-夾心ELISA 法已經用于檢測血清中的循環抗原（CAg），該方法使用雞抗體IgY 作為捕獲抗體和小鼠單克隆抗體35B9 作為檢測抗體，能檢測到加入正常小鼠血清中濃度低至1ng/ml的排泄分泌抗原，顯示出高靈敏度。此外，它對旋毛蟲病的早期診斷和療效評價具有一定的應用價值，這種以IgM 為基礎的單克隆抗體檢測可以作為檢測旋毛蟲抗體的補充方法[14]。

錐蟲病是由錐蟲感染所致的原蟲感染性疾病，該病在家畜中普遍存在、分布廣泛，是世界動物衛生組織列出的疾病之一。針對布氏錐蟲，剛果錐蟲、伊氏錐蟲開發的特異性單克隆抗體可用于間接ELISA 中的特定抗原分離和純化。

利什曼原蟲屬的原生動物寄生蟲引起一系列的疾病：從黏膜皮膚利什曼病到致命的利什曼病（VL）。不同種類利什曼原蟲特異性的單克隆抗體已被用于診斷利什曼原蟲蟲株。目前單克隆抗體可以分離并純化利什曼病抗原。針對印度杜氏利什曼原蟲的致病性前鞭毛體產生的單克隆抗體已用于免疫親和純化利什曼原蟲無鞭毛體和前鞭毛體中的78kDa 膜蛋白和識別子代利什曼原蟲的57kDa 抗原[15]。

惡性瘧原蟲入侵紅細胞需要運動連接的形成：運動連接復合物由在瘧原蟲表面的微線體蛋白（AMA）和瘧原蟲釋放后識別，并嵌入到宿主細胞膜的棒狀體頸蛋白（RONs），該復合物以AMA1-RON2 為骨架。PfAMA1 的結構研究表明，其在頂端存在保守的疏水區，協調RON2 和入侵的抑制肽。單克隆抗體與AMA1 疏水區特異結合后阻止運動連接的形成和誘導納蟲空泡的形成。根據結合在AMA1 疏水區附近的單克隆抗體，可以鑒定RON2 的結合位點，為潛在瘧疾疫苗提供新的靶點[16]。

3 結論

生物技術的進步有利于單克隆抗體的大規模批量生產，單克隆抗體可運用于多種疾病臨床診斷，如使用免疫熒光和ELISA 等方法檢測感染性病原體、抗原或對抗原感染產生的抗體。本綜述中討論的許多重要牲畜禽疾病的診斷方法將方便診斷人員和研究人員加強對疾病快速診斷的認識，為控制疾病提供更多、更好的選擇。