核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3、胱天蛋白酶-1、白細(xì)胞介素-1β在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及臨床意義

孫娜，莊濤，張永麗，曹勝涵，張蓓

作者單位：徐州醫(yī)科大學(xué)徐州臨床學(xué)院，江蘇 徐州 221000

據(jù)癌癥統(tǒng)計(jì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率和死亡率在國內(nèi)外均呈逐年上升趨勢(shì)，部分發(fā)達(dá)城市的子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率已達(dá)到女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第一位｛1-2］。作為一種多因素疾病，其病因不十分清楚。而近期大量研究表明，細(xì)胞焦亡的發(fā)生促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的改變，進(jìn)一步加快癌癥的發(fā)生發(fā)展［3-4］。細(xì)胞焦亡是由胱天蛋白酶（caspase）介導(dǎo)并伴隨炎癥反應(yīng)和參與機(jī)體免疫應(yīng)答的一種炎性細(xì)胞程序性死亡方式［5-6］。其經(jīng)典途徑是依賴于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）介導(dǎo)胱天蛋白酶-1（caspase-1）激活，切割消化道皮膚素D，在細(xì)胞膜上形成孔洞，使細(xì)胞脹裂死亡，引發(fā)細(xì)胞焦亡；同時(shí)caspase-1切割促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-1β前體（pro-IL-1β）和IL-18前體（pro-IL-18），形成具有活性的IL-1β、IL-18，大量釋放誘導(dǎo)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)［7］，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的改變，進(jìn)一步刺激腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展［8］。鑒于此，我們推測(cè)細(xì)胞焦亡可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。然而，細(xì)胞焦亡相關(guān)因子與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究甚少。為此，本研究探究細(xì)胞焦亡相關(guān)因子與子宮內(nèi)膜腺癌病人臨床病理特征及預(yù)后意義，為分子靶向治療及預(yù)后評(píng)估提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集徐州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科2014年1月至2016年12月行手術(shù)治療的病人組織蠟塊標(biāo)本，其中子宮內(nèi)膜腺癌組織121例，年齡范圍24~73歲，年齡（54.75±9.09）歲，F(xiàn)IGO分期：Ⅰ期85例，Ⅱ期15例，Ⅲ+Ⅳ期21例；高分化73例，中分化19例，低分化29例［9］。子宮內(nèi)膜不典型增生組織32例，年齡范圍32~68歲，年齡（47.4±8.28）歲；另選取50例同期行手術(shù)治療的正常增殖期子宮內(nèi)膜組織蠟塊，年齡范圍35~55歲，年齡（41.6±6.32）歲。組間年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。子宮內(nèi)膜腺癌納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理資料與臨床資料完整；（2）未接受過抗腫瘤治療，首次直接行手術(shù)治療；（3）本研究方案經(jīng)徐州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)同意（XZXY-LJ-20210513-055）病人或其近親屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、來自生殖系統(tǒng)其他器官腫瘤的轉(zhuǎn)移癌（包括原發(fā)性雙癌）、有院外治療史病人。

1.2 主要試劑兔抗人NLRP3抗體、兔抗人cas?pase-1抗體、兔抗人IL-1β抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自美國Affinity公司。

1.3 方法將組織切片60烘片1 h，分別用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10 min，100%、95%、85%、75%乙醇脫水各5 min，檸檬酸鹽修復(fù)抗原15 min，內(nèi)源性過氧化物酶去氧化20 min，一抗孵育過夜，二抗孵育30 min，分別用DAB染料顯色蘇木素染色，依次用75%、85%、95%、100%乙醇和二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫水，最后中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判讀結(jié)果判定由2名病理科醫(yī)生在雙盲條件下對(duì)IHC結(jié)果進(jìn)行判讀，標(biāo)準(zhǔn)如下：陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)<5%，5%~25%，>25%~50%，>50%~75%，>75%分別記為0，1，2，3，4分。根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度分：細(xì)胞無著色，細(xì)胞輕度著色，棕黃色者，深黃色者分別記為0，1，2，3分。結(jié)合染色陽性強(qiáng)度=陽性細(xì)胞百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度分，>3分為陽性，≤3分為陰性。

1.5 隨訪癌癥病人每3個(gè)月進(jìn)行電話隨訪或門診隨訪。以開始治療的時(shí)間為隨訪起始時(shí)間，截止日期為2021年1月和病人死亡日期。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Spearman等級(jí)相關(guān)分析各指標(biāo)間的關(guān)系，Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素及多因素生存預(yù)后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NLRP3、caspase-1、IL-1β在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示NLRP3，caspase-1，IL-1β陽性染色主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，部分著色于細(xì)胞核，呈棕黃色；各因子在不同子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達(dá)比例，見表1。

表1 NLRP3、caspase-1、IL-β在正常增殖期子宮內(nèi)膜組織（NET）、子宮內(nèi)膜不典型增生組織（AH）及子宮內(nèi)膜腺癌組織（EC）中的陽性表達(dá)/例（%）

2.2 子宮內(nèi)膜腺癌組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示NL?RP3與caspase-1，IL-1β表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.40，P<0.001，r=0.22，P=0.015），caspase-1與IL-1β表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.27，P=0.003）。

2.3 子宮內(nèi)膜腺癌組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系子宮內(nèi)膜腺癌中NLRP3表達(dá)與臨床分期、分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均<0.05）；Ⅲ+Ⅳ期、低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中NLRP3陽性表達(dá)率高于Ⅰ和Ⅱ期、高分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組織（P<0.05）。子宮內(nèi)膜腺癌組織中caspase-1表達(dá)與臨床分期分化相關(guān)（P<0.05）。IL-1β表達(dá)與臨床分期、分化、及肌層浸潤(rùn)相關(guān)（P<0.01），且IL-1β隨分化程度降低，浸潤(rùn)深度增加而增加。詳見表2。

表2 NLRP3、caspase-1、IL-1β與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理因素的關(guān)系/例（%）

2.4 子宮內(nèi)膜腺癌組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β表達(dá)與病人生存時(shí)間的關(guān)系對(duì)121例子宮內(nèi)膜癌病人進(jìn)行門診及電話隨訪，存活97例（80.2%），失訪6例（5.0%），死亡18例（14.9%）。NLRP3陽性組和陰性組病人5年總體生存率分別為77.3%（58/75）和97.8%（45/46）；NLRP3陽性組的病人預(yù)后相比陰性組病人預(yù)后差（χ2=9.46，P=0.002）。caspase-1陽性組和陰性組病人5年總體生存率分別為80.2%（69/86）和97.1%（34/35）；caspase-1陽性組的病人預(yù)后相比陰性組病人預(yù)后差（χ2=5.62，P=0.018）。IL-1β陽性組和陰性組病人5年總體生存率分別為79.1%（53/67）和92.6%（50/54），IL-1β陽性組的病人預(yù)后相比陰性組病人預(yù)后差（χ2=4.30，P=0.038）。

2.5 Cox回歸分析單因素Cox回歸分析顯示：FI?GO分期、分化、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、NLRP3、cas?pase-1、IL-1β與子 宮內(nèi)膜癌 病人預(yù)后 有關(guān)（P<0.05）。在校正了可能的混雜因素后，多因素Cox回歸分析得出FIGO分期、分化、NLRP3是子宮內(nèi)膜腺癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05），見表3。

表3 Cox多因素回歸分析子宮內(nèi)膜癌病人的預(yù)后影響因素

3 討論

致癌是一個(gè)多步驟的過程，包括從最初的致癌刺激開始到癌癥的最終表現(xiàn)，盡管不受控制的生長(zhǎng)是癌細(xì)胞的基本特征，但這些細(xì)胞也需要合適的微環(huán)境來生存和發(fā)展［10］。已有相關(guān)研究證實(shí)，炎性因子的變化可以引起微環(huán)境的改變，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移能力［11］。早在2005年，Modugno等［12］就提出子宮內(nèi)膜癌可能與長(zhǎng)期的炎性刺激有關(guān)的假說。

細(xì)胞焦亡是繼凋亡、壞死后的一種新形式的炎性細(xì)胞程序性死亡方式［13］。在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境刺激下，NLRP3先通過接頭蛋白間接連接caspase-1前體，形成一個(gè)高分子復(fù)合物即為炎性小體［14］，炎癥小體激活產(chǎn)生具有活性的效應(yīng)分子caspase-1，cas?pase-1切割I(lǐng)L-1β前體和IL-18前體形成活性致炎因子IL-1β、IL-18，同時(shí)切割GSDMD以誘導(dǎo)膜孔開放，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡［15］，進(jìn)一步引發(fā)促炎因子IL-1β，IL-18的釋放，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，引起微環(huán)境的改變，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［16］。既往研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Guo等［17］研究發(fā)現(xiàn)，與NLRP3炎癥小體野生型乳腺癌小鼠模型相比，NLRP3炎性體缺失的乳腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力明顯降低，其通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NLRP3炎癥小體激活促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。Daley等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中巨噬細(xì)胞中的NLRP3激活驅(qū)動(dòng)CD4+T細(xì)胞分化為TH2細(xì)胞、TH17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群，釋放大量炎性因子IL-1β、IL-18促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展，同時(shí)抑制Th1細(xì)胞極化和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞活化引起免疫抑制，進(jìn)一步加速胰腺癌的進(jìn)展。然而細(xì)胞焦亡在子宮內(nèi)膜癌中的作用有待進(jìn)一步研究。

基于此，本研究采用免疫組化方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺癌組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β高表達(dá)，這一結(jié)果與Liu等［19］的研究結(jié)果相同，不同的是本研究結(jié)果表明在子宮內(nèi)膜腺癌及子宮內(nèi)膜不典型增生組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β高表達(dá)所占比均高于正常子宮內(nèi)膜組織，且陽性表達(dá)逐漸增高，我們推測(cè)NLRP3、caspase-1、IL-1β的高表達(dá)在子宮內(nèi)膜正常到癌變的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用，而這3個(gè)因子均是焦亡經(jīng)典途徑中的重要相關(guān)因子，不難推測(cè)，焦亡可能促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)分期越晚、分化越低，肌層浸潤(rùn)越深，NLRP3、caspase-1、IL-1β陽性率越高，表明NLRP3、caspase-1、IL-1β可能參與子宮內(nèi)膜癌的分化浸潤(rùn)過程，具有促癌基因作用。我們進(jìn)一步對(duì)121例有臨床隨訪資料的子宮內(nèi)膜腺癌病人進(jìn)行Kaplan Meier生存曲線分析，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺癌病人中NL?RP3，caspase-1，IL-1β陽性表達(dá)者生存預(yù)后較陰性表達(dá)者差（P<0.05），證實(shí)焦亡相關(guān)因子影響子宮內(nèi)膜腺癌病人預(yù)后，進(jìn)一步提示細(xì)胞焦亡在子宮內(nèi)膜腺癌中的促癌作用；利用多因素Cox回歸分析得出分期、分化、NLRP3是子宮內(nèi)膜癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示NLRP3在治療效果預(yù)測(cè)中可能起到一定的臨床意義。同時(shí)本課題具有一定的局限性，未能體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確細(xì)胞焦亡調(diào)控子宮內(nèi)膜癌的分子作用機(jī)制，下一步我們將進(jìn)行機(jī)制研究，佐證臨床樣本研究結(jié)果。

綜上所述，本研究證實(shí)細(xì)胞焦亡相關(guān)因子NL?RP3、caspase-1、IL-1β在子宮內(nèi)膜腺癌表達(dá)上調(diào)，與病人的不良預(yù)后相關(guān)，揭示細(xì)胞焦亡可能參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展。NLRP3在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能作為潛在的預(yù)后分子標(biāo)志物，為腫瘤提供有效的治療靶點(diǎn)。