基于Toll樣受體4/核因子κB通路觀察香煙煙霧溶液刺激對人支氣管上皮樣細胞相關基因表達的影響

徐晨，王勝，李春穎

作者單位：1安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230000；2安徽中醫藥大學第一附屬醫院老年病中心呼吸內科，安徽 合肥 230000

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系統臨床常見病、多發病。2021 GOLD指南中將其明確定義為：COPD是一種常見的、可預防和可治療的疾病，這是因氣道和（或）肺泡異常所致，通常由于大量暴露于有毒顆粒或氣體并受到宿主因素的影響（包括肺部發育異常）。在我國，COPD總患病人數約1億［1］，其中60歲以上人群患病率超過27%。COPD患病人數多，患病人群病死率高，生活質量和勞動能力嚴重下降，對家庭和社會經濟造成巨大負擔，已成為一個亟須解決的重要公共衛生問題。目前已知氣道炎癥和黏液高分泌是COPD的顯著特征，Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信號參與COPD氣道炎癥反應，黏蛋白（MUC）是COPD氣道黏液高分泌的主要成分［2］。因此，本實驗于2020年8—12月通過沉默和過表達TLR4基因，利用實時熒光定量PCR法檢測香煙煙霧溶液（cigarette smoke extract，CSE）對人支氣管上皮樣細胞16HBE TLR4/NF-κB信號通路相關基因TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8 mRNA的表達，進一步闡釋TLR4/NF-κB信號通路在COPD發生中的機制。

1 材料與方法

1.1 材料人支氣管上皮樣細胞16HBE，購自上海中喬新舟生物科技有限公司；DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清（FBS）購自日本HAKA?TA公司；lipo8000轉染試劑購自碧云天公司；TLR4沉默干擾小RNA（siRNA）序列由上海漢恒生物公司合成；TLR4過表達質粒由上海吉凱基因公司合成；RNA提取試劑盒購自Life technogies公司；逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，PCR引物由Sangon Biotech公司合成；酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司；熒光定量PCR儀購自德國羅氏診斷有限公司；恒溫細胞培養箱購自美國Nuaire公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香煙煙霧溶液（CSE）的制備 自制簡易提取CSE的氣體抽動裝置，用1支香煙（雄獅牌，每支焦油含量8 mg，尼古丁含量0.7 mg，煙氣一氧化碳含量10 mg）連接膠管，另一頭膠管連接至裝有DMEM高糖培養基的無菌培養瓶，開動開關后香煙煙霧抽吸至培養基中，至香煙燃至5 mm處關閉開關，輕輕搖晃培養瓶至無煙霧，0.22μm濾頭過濾CSE后轉移至新的無菌培養瓶，酶標儀320 nm波長下檢測吸光度，當吸光度為1.00±0.05時定義該溶液為100%CSE［3］，-80℃超低溫冰箱儲存，每次實驗前取出現配現用。

1.2.2 細胞培養與傳代 將人支氣管上皮樣細胞16HBE細胞凍存管從-196.0℃液氮罐中取出，迅速放入37.0℃水浴鍋中快速搖晃至細胞懸液融化。在超凈臺內將細胞懸液移至含5 mL完全培養基（10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗溶液的90%DMEM高糖培養基）的15 mL離心管中，高速離心機1 200 r/min離心5 min后棄去上清。再加入5 mL完全培養基輕輕吹打細胞沉淀至均勻，將細胞懸液移至T25細胞培養瓶中，置于37.0℃、90%濕度、5%二氧化碳無菌培養箱中正常培養。2~3 d更換新鮮的完全培養基，當細胞長至培養瓶底面積80%~90%時即可傳代。

1.2.3 TLR4基因最佳沉默效果篩選（1）TLR4的siRNA序列由上海漢恒生物科技生物公司設計合成，包含3條不同序列的核苷酸鏈，以篩選出沉默效果最佳的siRNA，序列如表1所示。

表1 核苷酸鏈序列

（2）轉染前24 h，在6孔板中用不含雙抗的完全培養基中接種（2.0±0.2）×105/mL密度的16HBE，每孔1.5 mL，共設3個復孔，另設一組空白對照組及陰性對照NC組。各觀測資料的樣本量為3個平行樣×2次觀測=6。實驗分組及處理方法如表2所示。

表2 Toll樣受體4（TLR4）基因沉默篩選實驗分組及干預方法

（3）用250μL DMEM稀釋5μL siRNA，再用250μL的DMEM培養基稀釋5μL的lipo8000，輕輕吹吸3~5次混勻，室溫下靜置5 min。混合siRNA稀釋液和轉染試劑，室溫下靜置20 min。將轉染復合物加入到6孔板中，每孔500μL，前后輕搖培養板混合均勻，將培養板置于培養箱中。轉染完成后24 h取出培養板，收集細胞，使用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測目的基因TLR4的沉默效果，篩選沉默效率最高的siRNA。

1.2.4 TLR4基因過表達轉染 將處于對數生長期的16HBE消化、離心、重懸后以（2.0±0.2）×105/mL密度均勻鋪種于6孔板，每孔2 mL完全培養基培養24 h。24 h后細胞長至70%~80%后取出，更換新鮮完全培養基。準備無菌無酶的1.5 mL EP管，各EP管中加入125μL預熱的不含血清及雙抗的DMEM高糖培養基，再向其中1管加入2μL過表達Lv-TLR4質粒，另外1管加入等量的Lv-TLR4-NC（陰性對照）質粒，移液槍吹打3~5次，各管再加入4μL Li?po8000轉染試劑，輕輕吹打混勻，室溫下孵育10 min使復合物充分結合。輕輕前后水平搖晃培養板，將培養板放入培養箱中繼續培養。

1.2.5 qRT-PCR法檢測TLR4基因沉默和過表達后16HBE中相關基因mRNA的表達（1）實驗分組如表3。（2）收集各組細胞沉淀，TRIzol試劑提取細胞RNA，再將各組RNA逆轉錄成cDNA，qRT-PCR檢測各 組16HBE中TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8 mRNA表達水平，各檢測指標引物如表4所示。（3）得到各組的Ct值后保存，按照2-ΔΔCt法計算基因的擴增倍數。

表3 實驗分組及干預方法

表4 各檢測指標引物序列

1.3 統計學方法采用SPSS 26.0軟件進行統計。定量數據均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR4基因最佳沉默效果篩選與空白對照組（A組）相比，siRNA TLR4-1、2、3組（C、D、E組）TLR4 mRNA表達均降低（P<0.05）。與siRNA TLR4-1組（C組）相比，siRNA TLR4-2組（D組）TLR4 mRNA表達降低（P<0.05）；其中siRNA TLR4-2組（D組）TLR4 mRNA表達最低。因此在后續實驗中，選擇hs-TLR4-si-2作為TLR4基因沉默的最佳siRNA。見表5。

表5 TLR4基因最佳沉默效果篩選實驗中各組TLR4 mRNA相對表達量比較/±s

表5 TLR4基因最佳沉默效果篩選實驗中各組TLR4 mRNA相對表達量比較/±s

注：TLR4為Toll樣受體4。①和A組相比，P<0.05。②和B組相比，P<0.05。③和C組相比，P<0.05。

組別A組：空白對照B組：siRNA TLR4-NC C組：siRNA TLR4-1 D組：siRNA TLR4-2 E組：siRNA TLR4-3 F值P值重復次數66666 2-ΔΔCt 1.00±0.22 0.98±0.21 0.80±0.09①②0.47±0.04①②③0.62±0.05①②③16.94<0.001

2.2 TLR4基因沉默和過表達后16HBE中相關基因mRNA的表達與空白對照組（A組）相比，實驗組各指標mRNA表達均升高（P<0.05）；與CSE組（B組）相比，CSE+siRNA TLR4組（D組）各指標mRNA降低，CSE+Lv-TLR4組（F組）各指標mRNA表達升高（P<0.05）。與CSE+siRNA TLR4-NC組（C組）相比，CSE+siRNA TLR4組（D組）TLR4 mRNA降低（P<0.05）；與CSE+Lv-TLR4-NC組（E組）相比，CSE+Lv-TLR4組（F組）TLR4 mRNA表達升高（P<0.05）。見表6。

表6 TLR4基因沉默和過表達后各組TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8 mRNA相對表達量比較/±s

表6 TLR4基因沉默和過表達后各組TLR4、NF-κB、MUC5AC、MUC7、MUC8 mRNA相對表達量比較/±s

注：TLR4為Toll樣受體4，NF-κB為核因子κB，MUC為黏蛋白，CSE為香煙煙霧溶液。①和A組相比，P<0.05。②和B組相比，P<0.05。③和C組相比，P<0.05。④和D組相比，P<0.05。⑤和E組相比，P<0.05。

組別A組：空白對照B組：CSE C組：CSE+siRNA TLR4-NC D組：CSE+siRNA TLR4 E組：CSE+Lv-TLR4-NC F組：CSE+Lv-TLR4 F值P值重復次數6 6 6 6 6 6 TLR4 1.00±0.09 1.81±0.18①1.91±0.22①1.43±0.17①②③1.83±0.15①④2.42±0.06①②③④⑤96.18<0.001 NF-κB 1.00±0.04 1.65±0.11①1.66±0.10①1.12±0.05②③1.68±0.11①④1.94±0.07①②③④⑤57.61<0.001 MUC5AC 1.00±0.12 2.09±0.24①2.13±0.18①1.38±0.13①②③2.16±0.12①④2.56±0.19①②③④⑤80.42<0.001 MUC7 1.00±0.20 2.21±0.26①2.27±0.42①1.46±0.30①③2.29±0.34①④2.72±0.33①③④⑤22.75<0.001 MUC8 1.00±0.11 1.75±0.06①1.82±0.03①1.23±0.03①②③1.77±0.06①④2.10±0.10①②④⑤44.19<0.001

3 討論

目前已知COPD發病與香煙煙霧及環境微粒物關系密切，香煙煙霧及環境微粒物中至少包含7 000種化學物質和至少70種致癌物質［4-5］。香煙煙霧進入氣道后會導致氣道黏膜的通透性增加，使氣道黏膜物理屏障的作用及黏膜纖毛清除系統能力降低，從而抗氧化劑、蛋白酶抑制劑和抗菌肽生成不足，免疫細胞反應活性下調，參與COPD發病的關鍵過程［6］。其特征性病理改變為氣道的慢性炎癥和黏液高分泌，黏液高分泌導致多痰，在病人肺的不同部位有肺泡巨噬細胞、T淋巴細胞和中性粒細胞增加，激活的炎癥細胞釋放多種炎性介質包括白細胞介素（IL）-6、IL-8、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及其他炎性介質，這些介質能破壞肺的結構和促進炎癥反應從而導致COPD發生發展。研究發現，慢阻肺急性加重老年病人病人出現肺功能進行性下降，血清白蛋白、前白蛋白和體質量指數均會降低［7］。研究表明，CSE可在多種肺泡上皮細胞系如人肺腺癌上皮細胞A549、肺乳頭狀腺癌上皮細胞H441等以及人原代小氣道上皮細胞SAEC中引起氧化應激反應，CSE在SAEC中觸發NF-κB活化并且使促炎細胞因子釋放，而在所研究的任何轉化上皮細胞系中都沒有［8］。此外，在多種原代上皮細胞系的研究中［9］，16HBE比其他人支氣管上皮樣細胞如BEAS-2B具有更強的細胞間接觸性以及更高的抗性，這使得處在胞間的黏附因子緊密連接蛋白ZO-1和上皮鈣黏素（E-cad?herin）在16HBE中表達最高。黏附分子ZO-1及Ecadherin分別參與了形成了與氣道上皮屏障功能有關的緊密連接和黏附連接［10］，這些連接限制了細胞旁通透性，阻止了過敏原等微生物進入了氣道上皮下層。研究發現，哮喘病人的氣道上皮經常受損，通透性增加，導致ZO-1及E-cadherin的表達減少［11-12］。不僅如此，與16HBE細胞相比，BEAS-2B損傷后屏障功能的恢復受損，這也預示著16HBE細胞更適合用于屏障形成的研究，這些研究結果表明16HBE細胞可作為研究支氣管上皮屏障功能和損傷后細胞間連接重建的合適模型。因此實驗通過CSE對16HBE細胞刺激，擬造出符合COPD的細胞模型。

Toll樣受體（TLRs）是一類對病原相關分子模式特異性識別的模式受體家族，目前由10個成員組成（TLR1~10），TLRs的細胞質部分與IL-1受體家族高度相似，被稱為TIR結構域（TIR），已證實每種TLRs均能識別病原體的特定組分，從而證明哺乳動物免疫系統通過TLRs識別微生物成分來檢測病原體侵襲［13］。其中TLR4為一種跨膜蛋白，通過高效能識別模式可有效識別大部分革蘭陰性菌及病毒抗原，例如革蘭陰性菌的脂多糖即是TLR4的配體，這種微生物識別系統的核心特征之一就是TLRs激活微生物攻擊的免疫應答至關重要的信號通路，所有TLRs激活一個共同的信號通路導致NF-κB的激活［14］。TLR4受脂多糖等刺激信號刺激，使用TIR結構域的銜接蛋白MyD88，進行一系列磷酸化及泛素化級聯活動激活NF-κB，進入核內與DNA特定位點結合，啟動其靶基因轉錄，釋放表達炎癥細胞因子，通過炎性因子的釋放進一步誘導黏蛋白MUC過量產生。此外，NF-κB信號除了上述途徑間接刺激黏蛋白分泌，還可直接誘導黏蛋白MUC的產生和合成。MUC，具有黏彈性質的復合糖蛋白，其轉錄產物可通過糖基化的不同翻譯修飾后產生多種蛋白質，上述論述已知目前被鑒定黏蛋白基因中研究最廣泛的是MUC5AC，該基因主要從氣道黏膜下腺釋放。研究證明MUC5AC是可被誘導產生的，COPD與氣道MUC5AC表達增加有關，且MUC5AC的表達與氣流阻塞程度相關［15］。而且香煙煙霧刺激可增加COPD氣道上皮細胞中TLRs誘導的MUC5AC的產生［16］。Kesimer等［17］研究發現，各種黏蛋白均在特定的細胞中存在，MUC5AC定位于淺表氣道杯狀細胞，MUC7定位于黏膜下腺漿液細胞，MUC8定位于黏膜下腺黏液細胞。這些細胞所分泌的黏蛋白共同排列形成了一個雙層的氣道表面黏液屏障［18］。因此對于上述黏蛋白的研究有助于了解COPD病人黏蛋白調控的機制。

本實驗通過對TLR4基因的沉默以及過表達研究得知：CSE可激活TLR4/NF-κB信號通路，使TLR4基 因mRNA表 達 升 高，其 下 游 分 子NF-κB及MUC5AC、MUC7、MUC8 mRNA表達升高。對TLR4基因進行沉默干擾后，TLR4/NF-κB信號通路的激活上調，TLR4基因mRNA表達降低，下游分子NF-κB及MUC5AC、MUC7、MUC8 mRNA表達降低。而當TLR4基因過度表達后，TLR4/NF-κB信號通路的過度激活使TLR4基因mRNA表達顯著升高，信號通路下游的NF-κB及MUC5AC、MUC7、MUC8 mRNA表達升高。這表明TLR4/NF-κB信號通路與CSE所產生的氣道炎癥有關，且其下游相關基因及黏蛋白表達受TLR4基因調控，TLR4通過銜接蛋白MyD88誘導NF-κB信號通路［19］，TLR4的過度表達會加重CSE導致的氣道炎癥及COPD，抑制TLR4/NF-κB信號通路可在一定程度上減輕CSE所導致的氣道炎癥及COPD。楊麗霞等［20］研究發現，COPD病人外周血細胞中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA水平顯著升高，急性加重期病人上述指標最高，說明TLR4/NFκB信號通路處于活化狀態，且其活化程度與COPD病情危重程度有關。

綜上所述，CSE刺激下的16HBE細胞中TLR4、NF-κB及黏蛋白MUC5AC、MUC7、MUC8的表達與TLR4/NF-κB信號通路有關，TLR4/NF-κB信號通路與COPD發生機制密切相關，這為研究COPD發病機制提供了實驗證據，并且為之后藥物干預COPD抑制氣道炎癥和黏液高分泌帶來新的理論支持。