茯苓多糖對2型糖尿病大鼠絲裂原激活的蛋白激酶通路及胰島素抵抗的影響

李喬，張博

作者單位：中國中醫科學院廣安門醫院南區內分泌科，北京 102618

胰島素是體內唯一可降血糖的激素，胰島素抵抗（IR）是指胰島素促進葡糖攝取和利用率下降，導致機體代償性分泌過多，是2型糖尿病（T2DM）發病過程的中心環節，但關于IR發生機制尚不明確［1-2］。臨床常用二甲雙胍（MET）及噻唑烷二酮類等藥物改善IR和降低血糖［3-4］。近來研究顯示，一些中藥可明顯改善IR，茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，單獨或與其他草藥聯合使用，具有抗腫瘤、抗病毒和抗氧化應激等作用，可用于治療糖尿病及癌癥等，其有效成分為茯苓多糖（PAC）［5-6］，但關于PAC對T2DM IR的影響尚鮮有研究。因此2019年3—10月，本研究擬初步探究PAC對IR的影響及可能機制，以期為臨床IR治療研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF雄性SD大鼠，周齡范圍7~8周，體質量范圍200~220 g，購自南京君科生物工程有限公司（動物合格證號110322211100491580）。所有大鼠飼養在中國中醫科學院中藥研究所［SYXK（京）2020-0042］，于12 h/12 h光照/黑暗循環、溫度（23±1）℃、濕度為45%~55%的空調房間內進行常規飼料喂養，自由飲水。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 藥品與試劑PAC（貨號SP8930，純度≥90.0%）購自北京索萊寶科技有限公司，鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊（批號H20103017）購自北京協和藥廠；鏈脲佐菌素（STZ）（貨號111607-200301），純度>98%，購自Sigma公司；兔源一抗anti-磷酸化p38絲裂原激活的蛋白激酶（p-p38MAPK）（貨號PA5-110135）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）（貨號44-682G）、anti-JNK（貨號44-690G），鼠源anti-p38 MAPK（貨號AHO1202）、anti-GAPDH抗體（貨號AM4300），二抗羊抗鼠IgG（批號B-2752）、羊抗兔IgG（A32731）均 購自美 國Invitrogen公 司。日立7600全自動生化儀；雅培安妥Optium Xceed血糖/血酮儀；MODEL550酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 參照Barrière等［7］文獻方法采用高脂飼料結合腹腔注射STZ（65 mg/kg）制備T2DM大鼠模型，1周后尾靜脈采血測得空腹血糖≥16.7 mmol/L、體質量無明顯降低者為模型成功。按照隨機數字表法分為五組：T2DM組（灌胃等量生理鹽水）、二甲雙胍（MET）（0.65 mg·kg-1·d-1）組、PAC低（PAC-L，0.05 mg·kg-1·d-1）、中（PAC-M，0.10 mg·kg-1·d-1）、高劑量（PAC-H，0.20 mg·kg-1·d-1）組［8］，每組12只。另取12只正常喂養非T2DM大鼠為正常對組（NC組，灌胃等量生理鹽水），干預8周。給藥結束后，處死各組大鼠，腹主動脈采血，分離血清；另取肝臟組織置于液氮中保存備用。

1.2.2 血清生化指標檢測 采用全自動生化儀檢測各組大鼠空腹血糖、血清三酰甘油含量，采用放射性免疫法檢測空腹血清胰島素（FINS）含量，并計算胰島素抵抗指數（HOMA-IRI）及胰島素敏感指數（ISI），其中HOMA-IRI=空腹血糖×FINS/22.5，ISI=1/（空腹血糖×FINS）。

1.2.3 肝臟氧化應激指標水平檢測 制備各組小鼠肝臟組織勻漿上清液，采用比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛活性，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 肝臟組織MAPK通路相關及其磷酸化蛋白表達水平檢測 采用蛋白印跡法檢測各組大鼠肝臟組織中p-p38MAPK、p-JNK蛋白表達。取適量提取的各組大鼠肝臟組織總蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳變性，轉至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，依次添加一抗anti-p-p38 MAPK（稀釋比1∶1 000）、p38 MAPK（稀釋比1∶1 000）、anti-p-JNK（稀釋比1∶1 000）、an?ti-GAPDH（稀釋比1∶500）4℃孵育過夜，添加二抗IgG（稀釋比1∶5 000）室溫孵育1 h，顯色、曝片，用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行定量分析。

1.3 統計學方法采用SPSS 25.0統計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步多組間的兩兩比較采用SNKq檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PAC對T2DM大鼠血清生化指標的影響與NC組比較，T2DM組大鼠血清空腹血糖、FINS、三酰甘油含量顯著升高（P<0.05）；與T2DM組比較，MET組大鼠血清空腹血糖、FINS、三酰甘油含量顯著降低（P<0.05），PAC-L組、PAC-M組、PAC-H組大鼠血清空腹血糖、FINS、三酰甘油含量顯著降低，且呈劑量依賴性（P<0.05），其中PAC-M組優于MET組（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清生化指標含量的比較/（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠血清生化指標含量的比較/（mmol/L，±s）

注：FINS為空腹血清胰島素。①與NC組比較，P<0.05。②與T2DM組比較，P<0.05。③與MET組比較，P<0.05。④與PAC-L組比較，P<0.05。⑤與PAC-M組比較，P<0.05。

組別NC組T2DM組MET組PAC-L組PAC-M組PAC-H組F值P值鼠數12 12 12 12 12 12空腹血糖5.08±0.29 12.35±1.27①7.49±0.52①②7.54±0.53①②6.71±0.49①②③④5.93±0.36②③④⑤178.59<0.001 FINS 25.61±3.17 95.48±9.82①86.59±8.32①②88.37±8.25①②71.28±7.03①②③④56.93±4.89①②③④⑤154.48<0.001三酰甘油0.64±0.07 1.69±0.24①1.39±0.14①②1.43±0.13①②1.13±0.11①②③④0.92±0.08①②③④⑤88.97<0.001

2.2 PAC對T2DM大鼠胰島素敏感性的影響與NC組比較，T2DM組大鼠HOMA-IRI水平顯著升高，ISI水平顯著降低（P<0.05）；與T2DM組比較，MET組大鼠HOMA-IRI水平降低，ISI水平顯著升高（P<0.05），PAC-L組、PAC-M組、PAC-H組大鼠HOMAIRI水平降低，ISI水平顯著升高，且呈劑量依賴性（P<0.05）。其中PAC-M組優于MET組（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠胰島素敏感性的比較/±s

表2 各組大鼠胰島素敏感性的比較/±s

注：HOMA-IRI為胰島素抵抗指數，ISI為胰島素敏感指數。①與NC組比較，P<0.05。②與T2DM組比較，P<0.05。③與MET組比較，P<0.05。④與PAC-L組比較，P<0.05。⑤與PAC-M組比較，P<0.05。

組別NC組T2DM組MET組PAC-L組PAC-M組PAC-H組F值P值鼠數12 12 12 12 12 12 HOMA-IRI 5.81±1.05 62.56±5.11①47.73±4.42①②49.47±4.56①②31.14±3.03①②③④26.59±2.16①②③④⑤360.78<0.001 ISI/×10-3 7.69±0.14 0.86±0.05①1.53±0.09①②1.51±0.11①②2.14±0.12①②③④3.73±0.15①②③④⑤5 851.02<0.001

2.3 PAC對T2DM大鼠肝組織氧化應激的影響與NC組比較，T2DM組大鼠肝臟組織GSH-Px、SOD活性降低，丙二醛含量升高（P<0.05）；與T2DM組比較，MET組大鼠肝臟組織GSH-Px、SOD活性升高，丙二醛含量降低（P<0.05），PAC-L組、PAC-M組、PACH組大鼠肝臟組織GSH-Px、SOD活性升高，丙二醛含量降低，且呈劑量依賴性（P<0.05）。其中PAC-H組優于MET組（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠氧化應激指標水平的比較/±s

表3 各組大鼠氧化應激指標水平的比較/±s

注：GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶。①與NC組比較，P<0.05。②與T2DM組比較，P<0.05。③與MET組比較，P<0.05。④與PAC-L組，P<0.05。⑤與PAC-M組，P<0.05。

組別NC組T2DM組MET組PAC-L組PAC-M組PAC-H組F值P值鼠數12 12 12 12 12 12 GSH-Px/（U/mg）85.21±8.36 38.65±4.23①52.06±5.21①②45.57±4.48①②51.14±5.02①②③④63.78±5.86①②③④⑤100.87<0.001 SOD/（U/mg）65.87±5.52 35.29±3.15①56.02±4.32①②43.27±8.25①②54.58±4.05①②③④59.23±4.14②③④⑤55.76<0.001丙二醛/（μmol/g）7.04±1.05 13.39±1.16①8.57±1.14①②10.92±1.23①②8.69±1.15①②③④7.32±1.16②③④⑤53.18<0.001

2.4 PAC對T2DM大鼠肝組織MAPK通路相關蛋白表達的影響與NC組比較，T2DM組大鼠肝臟組織p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平顯著升高（P<0.05）；與T2DM組比較，MET組大鼠肝臟組織p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平顯著降低（P<0.05），PAC-L組、PACM組、PAC-H組大鼠肝臟組織p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平降低，且呈劑量依賴性（P<0.05）。其中PACM組優于MET組（P<0.05）。見圖1，表4。

圖1 蛋白質印跡法檢測各組大鼠肝臟組織p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平的表達

表4 各組大鼠肝臟組織p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平的比較/±s

表4 各組大鼠肝臟組織p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平的比較/±s

注：p-p38MAPK為磷酸化p38絲裂原激活的蛋白激酶，p-JNK為磷酸化c-Jun氨基末端激酶。①與NC組比較，P<0.05。②與T2DM組比較，P<0.05。③與MET組比較，P<0.05。④與PAC-L組，P<0.05。⑤與PAC-M組，P<0.05。

組別NC組T2DM組MET組PAC-L組PAC-M組PAC-H組F值P值鼠數12 12 12 12 12 12 p-p38MAPK 0.16±0.03 1.35±0.08①0.87±0.04①②1.04±0.06①②0.89±0.03①②③④0.39±0.02①②③④⑤990.40<0.001 p-JNK 0.17±0.02 1.29±0.08①0.74±0.04①②0.85±0.02①②0.72±0.05①②③④0.31±0.01①②③④⑤1 014.57<0.001

3 討論

茯苓是我國常用中草藥，性平，味甘淡，據《神農百草經》記載其“主胸膈逆氣，利小便，久服安魂補神，不饑延年”［9］，現代藥理學研究表明，PAC是其最主要活性成分，具有降血糖和抗脂質過氧化等作用［10-11］。Chen等［12］研究報道，茯苓可配伍甘草、柑桔、陳皮、半夏、竹節組成溫膽湯，經多途徑、多通路治療代謝綜合征。黃聰亮等［13］研究報道，PAC可有效降低T2DM小鼠血糖、血清胰島素及血脂水平，改善T2DM引起的脂質代謝紊亂。本研究采用高脂喂養SD大鼠結合注射STZ建立T2DM大鼠IR模型，與NC組比較，T2DM組大鼠血清空腹血糖、FINS、三酰甘油含量及HOMA-IRI水平顯著升高，ISI水平顯著降低，符合T2DM基本特征及IR臨床特點，提示造模成功。與T2DM組比較，PAC呈劑量依賴性降低空腹血糖、FINS、三酰甘油含量、HOMA-IRI水平，升高ISI水平，提示PAC可能對T2DM大鼠IR具有顯著改善作用。

IR是T2DM疾病發生過程中重要特征。肝臟是調節糖、脂代謝等能量調節的主要器官，肝臟IR在機體IR中占重要地位。本研究結果發現，與NC組比較，T2DM組大鼠肝臟組織GSH-Px、SOD活性降低，丙二醛含量升高；與T2DM組比較，PAC可呈劑量依賴性升高大鼠肝臟組織GSH-Px、SOD活性，降低丙二醛含量，提示在IR可引起機體氧化應激，破壞氧化與抗氧化動態平衡，而PCA可調節二者平衡，具有抗氧化應激、改善IR作用，與文獻報道一致［14-15］。

肝細胞胰島素信號轉導通路涉及環節眾多，其中以MAPK通路、PI3K通路等研究居多。MAPK可分為細胞外信號調節激酶（ERK）、p38、JNK和ERK5 4個亞族，其中p38 MAPK是一種重要應激信號傳導蛋白，可被高脂、高糖等多種內源性及（或）外源性信號分子激活［16］，抑制p38 MAPK信號轉導途徑可減輕氧化應激，改善高脂誘導的T2DM小鼠IR［3］。JNK可廣泛參與細胞分化和凋亡、胚胎發育、免疫反應及IR等多種生理病理過程［17-18］，下調JNK表達可改善IR［19］。本研究結果發現，與NC組比較，T2DM組大鼠肝臟組織p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平顯著升高；與T2DM組比較，PAC可呈劑量依賴性降低大鼠肝臟組織p-p38MAPK、p-JNK蛋白水平，提示PAC可能通過抑制MAPK通路激活，減輕T2DM氧化應激，改善胰島素抵抗。

綜上所述，PAC可改善T2DM大鼠胰島素抵抗，該作用可能與其抑制MAPK/p38MAPK、MAPK/JNK通路，減輕氧化應激有關。但關于PAC改善胰島素抵抗的作用過程是否涉及其他代謝通路，有待進一步深入探究。