蒲公英萜醇通過上調(diào)微小RNA-610表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲

宗桃梅，李其銀，楊登權(quán)，楊風(fēng)波

作者單位：1宜賓市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，四川 宜賓 644000；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，四川 南充 637000

鼻咽癌是一種來源于鼻咽黏膜的惡性腫瘤，晚期病人生存率較低，主要治療方式是放射治療，導(dǎo)致鼻咽癌治療失敗的關(guān)鍵原因之一是復(fù)發(fā)［1］。研究顯示中醫(yī)藥在鼻咽癌臨床治療中起重要作用［2］。蒲公英萜醇是從蒲公英中提取的三萜五環(huán)類化合物，具有抗炎、抗氧化的作用［3］。此外，還有抗腫瘤作用，研究報(bào)道蒲公英萜醇可抑制人肺癌細(xì)胞H1299、A549增殖以及肺癌細(xì)胞糖酵解水平［4］。乙酰蒲公英萜醇可阻礙肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲［5］。蒲公英萜醇對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的生長(zhǎng)有阻礙作用［6］。但目前尚不清楚蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制。研究報(bào)道m(xù)iRNA與腫瘤發(fā)病機(jī)制相關(guān)，可作為腫瘤診斷、治療、預(yù)后的靶點(diǎn)［7-8］。研究報(bào)道FEZF1-AS1靶向上調(diào)微小RNA（miR）-610表達(dá)可顯著抑制膀胱癌T24細(xì)胞增殖、侵襲和遷移、抑制細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］。過表達(dá)miR-610可有效抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［10］。然而miR-610在鼻咽癌中的功能，以及其是否參與蒲公英萜醇調(diào)控鼻咽癌生物學(xué)進(jìn)展目前還不清楚。因此，本研究于2019年4月至2020年1月，旨在探討蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其與miR-610的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料蒲公英萜醇（純度95%~99%）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；NP69細(xì)胞，鼻咽癌細(xì)胞6-10B、5-8F、SUNE1購自上海北諾生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自上海浩然生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)12633、10099-141）；MTT法試劑盒（貨號(hào)M2128）購自上海浩洋生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（貨號(hào)218073）購自北京麥瑞博生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液（AR0105）、二辛可寧酸（BCA）試劑盒（PT0006）購自上海恒斐生物科技有限公司；Matrigel（貨號(hào)356234）、Transwell小室（貨號(hào)354480）購自美國(guó)BD公司。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）（貨號(hào)PL03-04487）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）（貨號(hào)PL0502539）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）（貨號(hào)PL0401099）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）（貨號(hào)600274）多克隆抗體購自加拿大PLLABS公司；山羊抗兔IgG-HRP（貨號(hào)ANR02-1）購自上海子起生物科技有限公司。miR-610模擬物、miR-610抑制劑（an?ti-miR-610）購自美國(guó)ABI公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組NP69細(xì)胞，鼻咽癌細(xì)胞6-10B、5-8F、SUNE1用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），在37℃、含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用不同濃度（50、100、200μmol/L）的蒲公英萜醇對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SUNE1細(xì)胞處理，記為蒲公英萜醇低、中、高濃度組，正常培養(yǎng)且未經(jīng)蒲公英萜醇處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。將模擬物對(duì)照miR-NC、miR-610模擬物轉(zhuǎn)染至SUNE1細(xì)胞中，記為miR-NC組、miR-610組；將抑制劑對(duì)照anti-miR-NC、anti-miR-610轉(zhuǎn)染至SUNE1細(xì)胞后再用200μmol/L的蒲公英萜醇處理，記為蒲公英萜醇+anti-miR-NC組、蒲公英萜醇+anti-miR-610組。miR-610模擬物序列：TGAGCTAAATGTGTGCTGGGA；anti-miR-610序列：GGCTCAAATGTGTCCCAGC。

1.3 MTT檢測(cè)SUNE1細(xì)胞增殖SUNE1細(xì)胞經(jīng)1.2中的方法處理，48 h后，加入噻唑藍(lán)（MTT）溶液20μL反應(yīng)4 h，再加入DMSO 150μL，孵育10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（OD490nm）值。抑制率（%）=（1-OD值實(shí)驗(yàn)組/OD值空白對(duì)照組）×100%。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9表達(dá)提取培養(yǎng)48 h后的各組SUNE1細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定濃度。蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，室溫下用脫脂奶粉（5%）封閉1 h，加入一抗CyclinD1（1∶600）、p21（1∶1 000）、MMP-2（1∶800）、MMP-9（1∶800），4℃孵育過夜；加入1∶1 600稀釋的山羊抗兔IgGHRP二抗，室溫孵育90 min，用ECL發(fā)光液顯影，并用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像。用Quantity One軟件分析各組蛋白條帶的灰度值，蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=灰度值目的條帶/灰度值GAPDH條帶。

1.5 Transwell檢測(cè)SUNE1細(xì)胞遷移和侵襲遷移：將100μL細(xì)胞懸液（1×105細(xì)胞/mL）、600μL RPMI-1640完全培養(yǎng)液分別加入Transwell小室的上、下室，24 h后，用4%多聚甲醛、0.1%結(jié)晶紫各固定、染色30 min；顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。侵襲：將300μL無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液與60μL基質(zhì)膠（Matrigel）混勻，取100μL加入上室，凝固后按遷移操作進(jìn)行。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-610表達(dá)水平提取SUNE1細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cD?NA）后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL、SYBR Green Mix 10μL、正反向引物各0.5μL，水7μL；循環(huán)條件：95℃、5 min，95℃、15 s，62℃、60 s，72℃、10 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-610相對(duì)表達(dá)量。miR-610正向引物序列5'-TGAGCTAAATGTGTGCTGGGA-3'，反向引物序列5'-CCAGCACACATTTAGCTCATT-3'；U6正向引物序列5'-CGCTTCGGCAGCACATA-3'，反向引物序列5'-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3'。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。用SPSS 20.0軟件分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英萜醇影響鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖蒲公英萜醇低、中、高濃度組與對(duì)照組相比，抑制率和p21表達(dá)依次升高，CyclinD1表達(dá)依次降低（P<0.05），見圖1，表1。

表1 蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖的影響/±s

表1 蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖的影響/±s

注：CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1，p21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與蒲公英萜醇-低組比較，P<0.05。③與蒲公英萜醇-中組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組蒲公英萜醇-低組蒲公英萜醇-中組蒲公英萜醇-高組F值P值重復(fù)次數(shù)9999抑制率/%0.00±0.00 16.72±1.42①31.95±2.95①②54.59±5.06①②③533.48<0.001 CyclinD1蛋白0.66±0.05 0.54±0.04①0.41±0.04①②0.25±0.03①②③168.91<0.001 p21蛋白0.32±0.03 0.47±0.05①0.61±0.05①②0.78±0.06①②③146.15<0.001

圖1 蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.2 蒲公英萜醇影響鼻咽癌SUNE1細(xì)胞遷移、侵襲蒲公英萜醇低、中、高濃度組與對(duì)照組相比，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9表達(dá)依次下降（P<0.05），見表2；圖2，3。

表2 蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞遷移、侵襲的影響/±s

表2 蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞遷移、侵襲的影響/±s

注：MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與蒲公英萜醇-低組比較，P<0.05。③與蒲公英萜醇-中組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組蒲公英萜醇-低組蒲公英萜醇-中組蒲公英萜醇-高組F值P值重復(fù)次數(shù)9999遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)86.71±7.05 70.02±5.72①56.49±5.35①②43.37±4.19①②③96.48<0.001侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)69.12±4.80 50.70±4.41①39.12±3.89①②26.28±2.78①②③182.25<0.001 MMP-2蛋白0.53±0.05 0.41±0.04①0.29±0.02①②0.18±0.02①②③167.69<0.001 MMP-9蛋白0.62±0.04 0.49±0.03①0.35±0.03①②0.21±0.02①②③296.45<0.001

圖2 蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞遷移、侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200）

圖3 蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 miR-610在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)NP69細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞6-10B、5-8F、SUNE1中miR-610表達(dá)水平分別為（1.00±0.08、0.63±0.06、0.52±0.05、0.36±0.04），四個(gè)細(xì)胞系間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=188.83，P<0.05）。與NP69細(xì)胞比較，鼻咽癌細(xì)胞6-10B、5-8F、SUNE1中miR-610表達(dá)水平降低，且在SUNE1細(xì)胞中表達(dá)水平最低（P<0.05）。故本研究選擇SUNE1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

2.4 蒲公英萜醇影響鼻咽癌SUNE1細(xì)胞中miR-610表達(dá)對(duì)照組與蒲公英萜醇低、中、高濃度組miR-610表達(dá)水平分 別 為（1.00±0.06、1.68±0.14、2.37±0.21、3.09±0.29），四組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=192.01，P<0.05）。與對(duì)照組相比，蒲公英萜醇低、中、高濃度組miR-610表達(dá)水平升高，且呈濃度依賴性（P<0.05）。

2.5 miR-610過表達(dá)影響鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲miR-610組與miR-NC組相比，miR-610表達(dá)水平、抑制率增高，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)和CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)下降，p21表達(dá)增高（P<0.05），見圖4，5；表3。

表3 miR-610過表達(dá)對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

表3 miR-610過表達(dá)對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

注：miR-NC為模擬物對(duì)照，miR-610為miR-610模擬物，CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1，p21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9。

組別miR-NC miR-610 t值P值重復(fù)次數(shù)99 miR-610 1.00±0.06 2.95±0.28 20.43<0.001抑制率/%7.11±0.74 46.66±4.48 26.13<0.001遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)87.40±6.86 52.18±5.35 12.15<0.001侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)70.27±5.39 33.11±3.29 17.65<0.001 CyclinD1 0.68±0.04 0.29±0.03 23.40<0.001 p21蛋白0.31±0.03 0.71±0.05 20.58<0.001 MMP-2蛋白0.57±0.05 0.25±0.03 16.46<0.001 MMP-9蛋白0.61±0.05 0.29±0.02 17.83<0.001

圖4 miR-610過表達(dá)對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞遷移、侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200）

2.6 抑制miR-610表達(dá)可逆轉(zhuǎn)蒲公英萜醇抗鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用蒲公英萜醇+anti-miR-610組與蒲公英萜醇+anti-miR-NC組相比，miR-610表達(dá)水平及細(xì)胞增殖抑制率降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)和CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平升高，p21表達(dá)水平降低（P<0.05），見圖6，表4。

圖5 miR-610過表達(dá)對(duì)鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖6 抑制miR-610表達(dá)對(duì)蒲公英萜醇處理的鼻咽癌SUNE1細(xì)胞遷移、侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200）

表4 抑制miR-610表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒲公英萜醇阻礙鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用/±s

表4 抑制miR-610表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒲公英萜醇阻礙鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用/±s

注：miR-610為miR-610模擬物，CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1，p21為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9。

組別蒲公英萜醇+anti-miR-NC蒲公英萜醇+anti-miR-610 t值P值重復(fù)次數(shù)99 miR-610 1.00±0.08 0.59±0.05 13.04<0.001抑制率/%55.23±5.66 20.54±2.04 17.30<0.001遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)41.60±4.04 77.82±7.46 12.81<0.001侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)23.15±2.84 57.88±4.45 19.74<0.001 CyclinD1 0.23±0.02 0.56±0.05 18.38<0.001 p21蛋白0.79±0.06 0.39±0.03 17.89<0.001 MMP-2蛋白0.16±0.02 0.42±0.04 17.44<0.001 MMP-9蛋白0.20±0.02 0.51±0.04 20.80<0.001

3 討論

鼻咽癌的主要治療方式是放療，但其毒副作用大，而中醫(yī)藥可減少放化療的不良反應(yīng)，提高機(jī)體免疫力，改善病人生活質(zhì)量［11］。研究報(bào)道蒲公英萜醇可通過mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7自噬［12］。蒲公英萜醇還可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞和膀胱癌T24細(xì)胞凋亡［13-14］。以上研究表明蒲公英萜醇具有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖、遷移的作用。然而蒲公英萜醇是否對(duì)鼻咽癌具有抗癌作用還尚不清楚。因此本研究主要目的即研究蒲公英萜醇是否對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有影響。首先本研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英萜醇可劑量依賴地抑制鼻咽癌細(xì)胞SUNE1的增殖、遷移和侵襲，并下調(diào)Cy?clinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)，提高p21表達(dá)。本研究結(jié)果證明了蒲公英萜醇對(duì)鼻咽癌具有抗癌作用，與上述其他研究關(guān)于蒲公英萜醇抗癌的作用相同。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA影響腫瘤的進(jìn)展過程，miR-610是眾多miRNA的一種，研究表明miR-610在膀胱癌中低表達(dá)，其表達(dá)水平與組織分化程度、臨床分期相關(guān)［15］。miR-610對(duì)結(jié)腸直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲有抑制作用［16-17］。miR-610靶向間隙連接α-3蛋白阻礙人肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖［18］。miR-610通過直接抑制CCND2和AKT3的表達(dá)來介導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的抑癌作用［19］。上述研究表明miR-610在多種癌癥中起抗癌作用，因此，推測(cè)miR-610或在鼻咽癌中也起抗癌作用。為驗(yàn)證本研究假設(shè)，本研究首先檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞6-10B、5-8F、SUNE1中miR-610的表達(dá)水平降低，結(jié)果顯示，miR-610表達(dá)水平均顯著降低，且在SUNE1細(xì)胞中表達(dá)最低，因此，本研究主要以SUNE1為研究對(duì)象。本研究進(jìn)一步過表達(dá)miR-610后，鼻咽癌細(xì)胞SUNE1的增殖，遷移和侵襲均被抑制，證實(shí)了miR-610在鼻咽癌中起抑癌基因的作用。與在其他癌癥中的作用類似。此外，為研究蒲公英萜醇影響鼻咽癌的機(jī)制是否與miR-610有關(guān)，本研究檢測(cè)了不同濃度蒲公英萜醇處理的鼻咽癌細(xì)胞SUNE1中miR-610的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-610表達(dá)水平升高，表明蒲公英萜醇可影響鼻咽癌細(xì)胞SUNE1中miR-610的表達(dá)。此外，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了抑制miR-610表達(dá)可逆轉(zhuǎn)蒲公英萜醇抗鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。以上結(jié)果均提示，蒲公英萜醇可通過調(diào)控miR-610表達(dá)影響鼻咽癌SUNE1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。但蒲公英萜醇是否直接調(diào)控miR-610表達(dá)尚不清楚。

綜上所述，蒲公英萜醇可能通過上調(diào)miR-610表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；將可為鼻咽癌的中藥治療提供理論及參考依據(jù)；但本研究?jī)H在體外細(xì)胞進(jìn)行研究，是否在體內(nèi)發(fā)揮影響尚不清楚，且本研究蒲公英萜醇抗鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的機(jī)制是否與直接調(diào)控miR-610表達(dá)以及其是否與調(diào)控一些信號(hào)通路有關(guān)也尚不清楚，這是本研究的局限之處，均有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。