夏慈消結(jié)散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

馬燕，陳浩，章俊如，高家榮，汪永忠，方朝暉

作者單位：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥 學(xué)部，安徽 合肥 230031

夏慈消結(jié)散由夏枯草、酒白芍、穿心蓮、莪術(shù)等八味中藥組成，為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院擬申報(bào)的院內(nèi)制劑，用于治療甲狀腺結(jié)節(jié)、甲狀腺腫大、甲狀腺囊腫及各類良性甲狀腺腫、淋巴結(jié)腫大等。為保證夏慈消結(jié)散質(zhì)量穩(wěn)定可靠，本研究于2021年4—8月采用薄層色譜法對散劑進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相測定夏慈消結(jié)散中的芍藥苷、迷迭香酸及穿心蓮內(nèi)酯含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥KQ3200DB超聲清洗機(jī)（江蘇省昆山市超聲儀器公司）；BP211D型號電子天平（德國-Sartorius）；AgiLent 1260高效液相色譜儀器（美國安捷倫公司）。

夏慈消結(jié)散（批號20210201~20210203）；使用對照品為中國食品藥品檢定研究院迷迭香酸（批號111871~202007），芍藥苷（批號110736~20204），穿心蓮內(nèi)酯（批號110797~202010），吉馬酮（批號111665~201906），純度均>98%；色譜甲醇（美國Fisher公司），水為超純水；其他試劑均是國藥集團(tuán)分析純。

1.2 方法

1.2.1 薄層鑒別

1.2.1.1 夏枯草的薄層色譜鑒別[1-2]取夏慈消結(jié)散10 g，加75%乙醇100 mL，索氏提取2 h，收集提取液，濃縮至干，加50 mL水，超聲溶解，使用乙酸乙酯振搖并提取2次，每次50 mL，合并乙酸乙酯溶液，揮干，加甲醇1 mL溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤骸Ｈ∪毕目莶蓐幮詷悠罚ㄖ瞥申幮詫φ杖芤骸Ｈ∶缘闼釋φ掌罚蛹状贾瞥擅亢辽? mg的溶液，制為對照品溶液。照薄層色譜法（2020年《中國藥典》中四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸（15∶3∶3.5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在供試品薄層色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺夏枯草陰性對照未見相同斑點(diǎn)。見圖1。

1.2.1.2 酒白芍的薄層色譜鑒別[3-5]按“1.2.1.1”供試品溶液制備至加水50 mL，超聲溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2次，每次50 mL，合并正丁醇溶液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺酒白芍陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。取芍藥苷對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2020年《中國藥典》中四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以臨用新制的5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在供試品薄層色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，缺酒白芍陰性對照未見相同斑點(diǎn)。見圖2。

圖2 酒白芍的薄層色譜鑒別圖

1.2.1.3 穿心蓮的薄層色譜鑒別[6-7]按“1.2.1.1”供試品溶液制備至加水50 mL，超聲溶解，再加二氯甲烷振搖提取2次，每次50 mL，合并二氯甲烷溶液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺穿心蓮陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。取穿心蓮內(nèi)酯對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2020年《中國藥典》中四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，采用“1.2.1.2”中酒白芍的TLC鑒別中的展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視（圖3A），再噴以臨用新制1%香蘭素硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰（圖3B）。在供試品薄層色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黑褐色斑點(diǎn)，缺穿心蓮陰性對照未見相同斑點(diǎn)。

圖3 穿心蓮的薄層色譜鑒別圖：A為紫外光燈（254 nm）顯色圖；B為日光燈顯色圖

1.2.1.4 莪術(shù)的薄層色譜鑒別[8-10]按“1.2.1.1”供試品溶液制備至加水50 mL，超聲溶解，再加石油醚振搖提取2次，每次50 mL，合并石油醚溶液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺莪術(shù)陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。取吉馬酮對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2020年《中國藥典》中四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，采用石油醚-丙酮-乙酸乙酯（94∶5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以臨用新制的1%香蘭素硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在供試品薄層色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺莪術(shù)陰性對照未見相同斑點(diǎn)。見圖4。

注：1—迷迭香酸對照品；2—批號20210 201； 3—批號20210202；4—批號20210203； 5—缺夏枯草散劑。

圖4 莪術(shù)的薄層色譜鑒別圖

1.2.2 含量測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：以甲醇為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：230 nm；進(jìn)樣量：10μL；室內(nèi)溫度25℃。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2.2 溶液的制備 取芍藥苷、迷迭香酸和穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1毫升分別含芍藥苷120μg，迷迭香酸70μg和穿心蓮內(nèi)酯250μg的混合溶液，作為對照品溶液。精密稱取約1 g夏慈消結(jié)散，加入10 mL色譜甲醇溶液，超聲15 min，冷卻后補(bǔ)足色譜甲醇，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取處方中除夏枯草、酒芍藥、穿心蓮?fù)獾钠渌幉模聪拇认Y(jié)散制備方法制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性試驗(yàn) 分別吸取“1.2.2.2”項(xiàng)下的對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液各10μL，按“1.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，陰性樣品溶液在與芍藥苷、迷迭香酸和穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明專屬性良好。

圖5 夏慈消結(jié)散的高效液相色譜圖：A為供試品溶液；B為混合對照品溶液；C為陰性對照溶液

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.2.2”項(xiàng)下的濃度的對照品溶液，分別進(jìn)樣1、2.5、5、10、15、50μL。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得各組分線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芍藥苷、迷迭香酸和穿心蓮內(nèi)酯呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 夏慈消結(jié)散三種主成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液5μL，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）值。結(jié)果顯示，芍藥苷、迷迭香酸和穿心蓮內(nèi)酯的峰面積RSD分別為1.11%、0.41%和0.36%，見表3，說明精密度良好。

表3 夏慈消結(jié)散精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“1.2.2.2”項(xiàng)下的方法分別制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，記錄芍藥苷、迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯的峰面積，并折算成含量。結(jié)果顯示，芍藥苷、迷迭香酸和穿心蓮內(nèi)酯的含量RSD為1.11%、2.38%和1.30%，結(jié)果見表4，表明該方法重復(fù)性良好。

表4 夏慈消結(jié)散重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按照擬定的色譜條件，每隔0 h，8 h，16 h，24 h，36 h測定一次樣品。按“1.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL，測定峰面積，結(jié)果顯示，芍藥苷、迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯的含量RSD為2.76%、2.62%和0.95%，結(jié)果見表5，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 夏慈消結(jié)散穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知三種主成分含量的散劑樣品20210202批9份，在線性范圍內(nèi)分別加入一定量的芍藥苷、迷迭香酸、穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液，共9份，按“1.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，按公式計(jì)算回收率。結(jié)果詳見表6。

表6 夏慈消結(jié)散加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2 樣品的含量測定取3批不同批號的夏慈消結(jié)散樣品，按“1.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定芍藥苷、迷迭香酸和穿心蓮內(nèi)酯的含量。結(jié)果見表7。

表7 夏慈消結(jié)散顆粒中三種成分含量測定結(jié)果/（mg/g）

3 討論

本研究研究夏慈消結(jié)散中夏枯草、酒白芍、穿心蓮、莪術(shù)的薄層鑒別，主要參考藥典的方法［11］，而在處理供試品上，參考相應(yīng)的文獻(xiàn)［12-14］，采用結(jié)合所含成分極性的差異方法。夏枯草中的迷迭香酸極性中等，萃取時(shí)采用乙酸乙酯；酒白芍的芍藥苷極性較大，采用水飽和正丁醇進(jìn)行萃取；穿心蓮中的穿心蓮內(nèi)酯極性略低，采用二氯甲烷進(jìn)行萃取；莪術(shù)中的吉馬酮極性較低，采用石油醚萃取，獲得檢測主成分。由于吉馬酮屬于單帖類成分，共軛鍵少，紫外吸收不強(qiáng)，在紫外燈（254 nm）下未能檢視，故采用顯色劑顯色。穿心蓮中的穿心蓮內(nèi)酯的顯色，采用中國藥典方法：在紫外燈（254 nm）下進(jìn)行觀察，顯色并不明顯，再增加采用臨用新制的1%香蘭素硫酸乙醇，發(fā)現(xiàn)結(jié)果顯色明顯，鑒別更易。在展開劑選擇方面，檢測穿心蓮中的穿心蓮內(nèi)酯和酒白芍中的芍藥苷時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩者極性相似，故采用相同的展開劑展開，取得了良好的效果，簡化了鑒別過程。本研究采用的薄層色譜鑒別方法穩(wěn)定，得到的色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對照沒有干擾，適用于夏慈消結(jié)散鑒別。

本研究含量測定方法中對芍藥苷、迷迭香酸及穿心蓮內(nèi)酯的含量測定，我們主要參考了藥典中芍藥、夏枯草和穿心蓮含量測定的方法以及相關(guān)文獻(xiàn)［15-18］。通過試驗(yàn)研究，在進(jìn)行含量測定中，使用混合對照品的溶液，采用230 nm波長，同時(shí)測定夏慈消結(jié)散劑中芍藥苷、迷迭香酸和穿心蓮內(nèi)酯三個(gè)主成分，簡化了含量測定方法［19］。

本研究內(nèi)容主要建立了院內(nèi)制劑夏慈消結(jié)散中4味中藥的TLC以及其中3種主要成分的HPLC含量測定方法，該方法在靈敏度、專屬性、重現(xiàn)性上都優(yōu)異，同時(shí)簡便易行，可用于院內(nèi)制劑夏慈消結(jié)散的質(zhì)量控制。