PTC-T542乳粉中沙門氏菌檢測能力驗證 結果與分析

◎ 馬小筱

（廣州市番禺質量技術監督檢測所，廣東 廣州 511400）

沙門氏菌（Salmonellaspp.）是一種常見的人畜共患病原菌，對人類和動物都有極大危害。食物傳播是人類感染沙門氏菌的主要途徑，尤其是近年來，方便快餐、快熟食品、冷凍食品的盛行，在增加沙門氏菌污染可能性的同時也加大了沙門氏菌檢出的難度，因此通過參加能力驗證來提高檢測人員素質，增加檢驗經驗，準確分離出沙門氏菌，找出污染源，降低感染此病菌的潛在危險。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源

大連海關技術中心PTC—T542乳粉中沙門氏菌能力驗證樣品：凍干粉PTC213和PTC221；沙門氏標準菌株。傷寒沙門氏（FSCC215009(CMCC(B)50071)）標準菌株，將此傷寒沙門氏標準菌復蘇后用瓷珠保存于-18 ℃冰箱，此標準菌株的本實驗室編號為WB1，本次實驗取一株編號為WB1的標準菌珠進行復蘇做陽性對照實驗用（實驗編號為：WB1-2A）。

1.2 儀器與試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、沙門氏顯色培養基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）和沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，以上試劑均來自廣州陸橋；沙門氏菌O多價血清（A-F）（寧波天潤，批號20210101）；生化培養箱；生物安全柜等。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理與預增菌

本次能力驗證樣品為采用西林瓶包裝的凍干粉，來樣編號分別為PTC213、PTC221。根據指導書說明，用75%的滅菌酒精棉球擦試西林瓶外包裝，小心開啟西林瓶，先用3 mL滅好菌的0.85%的生理鹽水對西林瓶中的干粉進行水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，用生理鹽水反復沖洗西林瓶，共收集清洗液25 mL，加入225 mL BPW，進行預增菌。同時取一株本實驗室標準儲存菌珠進行復蘇，同步進行實驗，作陽性對照。將以上測試樣品輕輕搖勻分別標注為PTC213、PTC221、WB1-2A，置于（36±1）℃的培養箱中，預增菌8～18 h，8 h后每隔1 h觀察增菌液的變化，并分別在8 h、12 h、16 h、18 h分別進行一次增菌培養及后續實驗，從分離在選擇性培養基上的目標菌生長性情況來看，前增菌16～18 h的結果比較理想，接下來的實驗結果均取自前增菌18 h的緩沖液作為最終結果。

1.3.2 選擇性增菌

輕搖盛裝編號為PTC213，PTC221及WB1-2A BPW緩沖液的三角瓶，分別吸1 mL培養混合物加入10 mL SC和10 mL TTB中，將SC置于（36±1）℃的 培 養 箱；TTB置于（42±1）℃培養 箱，培 養（18～24）h。培養24 h菌液均有輕微的渾濁現象。

1.3.3 劃線分離

分別用3 mm的接種環取一環SC的培養物分別劃線于一個BS平板和一個沙門氏顯色平板和一個XLD平板；TTB中的培養物做同樣操作。置于（36±1）℃培養箱，BS平板培養40～48 h，沙門氏顯色平板和XLD平板培養18～24 h。結果如表1及圖1所示。

表1 選擇性增菌液SC中分離在各平板上的菌落形態表

圖1 沙門氏菌典型菌落在各選擇性培養基上的圖示

1.3.4 純培養及生化實驗

（1）挑取PTC213選擇性培養基上①②③（圖1 圖片中序號）所描述的典型菌落3個分別接種三糖鐵（生化反應現象如圖2示）及營養瓊脂做純培養，（36±1）℃培養18～24 h，挑24 h內新鮮純培養的菌落做相應的生化實驗和血清學鑒定（生化實驗按陸橋干制生化鑒定試劑盒操作說明書進行操作）。

（2）對PTC221選擇性培養基上Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所描述的典型菌落及WB1-2A標準菌株同步進行如（1）中試驗操作。結果描述如表2、圖2；各生化反應結果列舉如表3所示。

2 結果與分析

由以上實驗得出結果如表2、圖2所示，結合表3 生化反應現象，依照《食品安全國家標準 食品微生物檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）[1]中表2、 表3得 出：PTC221+BPW+SC-PTC-Ⅰ號 為A3型可疑沙門氏，依照國標ONPG的生化反應應為陰性，本實驗得出ONPG為陽性，血清實驗為自凝菌落，可判為非沙；依照GB4789.4—2016表2可得出PTC221+BPW+SC-PTC-Ⅲ和PTC213+BPW+TTB—③為非沙；PTC213+BPW+TTB－①/②及WB1-2A標準菌株生化反應現象完全符合典型沙門氏生化現象，結合血清學鑒定判定為沙門氏檢出。

表2 可疑菌落在三糖鐵上呈現的結果表

圖2 可疑菌落在三糖鐵上呈現的圖示

表3 生化現象及結果判定表

3 要點分析

3.1 關于預增菌和增菌

隨著現代方便食品的盛行，食品加工工藝也隨之變化，而食品加工過程中的加熱、干燥、冷凍、機械處理等加工工藝使得沙門氏菌細胞膜遭到了不同程度的損傷，使其處于比較弱的活性或瀕死狀態，緩沖蛋白胨水（BPW）具有較高的pH緩沖體系且為非選擇性培養基，有助于修復受損的細胞膜，還能復蘇處于冷凍休眠狀態的細菌，但同時其他雜菌也同樣得到修復與生長，雜菌太多往往會掩蓋住目標菌，因此控制好預增菌的時間是非常關鍵的一個程序。

選擇性增菌液會促進相應種群的沙門氏菌生長，同時抑制其他菌落的生長，而目前已知的沙門氏菌血清分型已有2 500多種[2]，因此沙門氏菌選擇性增菌液最好多選擇幾種增菌液進行增菌，本文按國標 GB 4789.4—2016中的方法分別選擇TTB和SC兩種增菌液進行增菌，本次能力驗證試驗中編號為PTC213的樣品，自SC增菌液中分離在3種選擇性培養基上均無菌落生長，自TTB增菌液中分離在沙門氏顯色及XLD培養基上均有典型菌落生長。如果本次實驗只選擇一種增菌液進行增菌，就會造成沙門氏漏檢的可能性。SC比較適合傷寒沙門氏菌的生長，而對其他沙門氏菌具有抑制的作用。從本實驗結果來看，本實驗室標準儲備菌株在SC中生長良好，三糖鐵上表現為不發酵糖不產氣，產少量的硫化氫，符合典型的傷寒沙門氏菌生化反應特征，而本次能力驗證試驗PTC213檢出沙門氏菌雖然生化反應與典型沙門氏菌生化完全吻合，但是其在BS上完全不生長，周正等[3]研究用鼠傷寒沙門氏和傷寒水氏在BS上均生長良好，另外其在三糖鐵上有大量的H2S產出，由此可以排除編號PTC213檢出沙門氏菌為非鼠傷寒沙門氏、非傷寒沙門氏，具體哪種沙門氏菌還需要進一步研究。

3.2 關于生化實驗

（1）關于商品化生化配套試劑盒。本實驗室連續10年均采用廣州陸橋的生化試劑盒作為生化鑒定的方法，從驗證實驗結果來看，目前還比較滿意，需要注意以下4點。①菌懸液的濃度不要太高，太高容易引起假陽性。②由于各個生化孔是連在一起的，加液和取放均要小心，避免因加液及晃動的過程中引起試劑間的交叉污染，從而造成結果偏差。③按照說明書進行操作并注意額外添加物的添加量及培養時間。④選擇純培養24 h左右的新鮮菌苔進行生化及血清學試驗，因為此時的菌落處于活躍期，生化反應最為靈敏。

（2）關于檢測方法的討論。目前對沙門氏的檢驗有實時熒光PCR方法、酶聯免疫（ELISA）方法、人工培育等方法[4-5]。食品中的微生物需要在一定條件和一定的機制下產生腸毒素或是代謝產物或是其繁殖生長到一定的量才能引起人或動物的中毒或疾病，這就要求這些病菌具有一定的活性，人工培育的方法檢測的準確率是目前各方法中最好的，但需要檢測人員具有豐富的經驗，而目前PCR及ELISA方法已經得到較好的發展，但對實驗室環境要求較高，對基礎實驗來說實現的難度也比較大，因而在有關致病菌檢測研究的文章中稱經典的細菌培養方法是致病菌檢測的金標準[4]。

3.3 關于菌體抗原的要點分析

GB 4789.4—2016中要求，血清學分型為選做項目本次試驗不做考究，對沙門氏血清鑒定中的菌體抗原：首先排除自凝現象，再進行相應的血清抗原實驗[6]。

（1）O多價抗原。多數沙門為O抗原，在O多價血清中有明顯的沙粒狀凝集現象，如果O多價不凝也不能輕易放棄，尤其選擇性培養基典型菌落特征明顯，生化現象也符合的情況下，此時需排除是否因莢膜的原因導致O多價不凝，可將菌苔接種在高瓊脂含量的培養基（2%～5%），反復進行試驗，目的因菌株在高瓊脂含量的培養基上，莢膜發育不良，這樣反復培養就可以破壞其莢膜，暴露其菌體抗原，本次試驗PTC213+BPW+TTB－①號菌就是這種情況，在接種3%瓊脂含量的培養基做二次純培養后，O多價血清出現了明顯的凝集現象。

（2）Vi抗原的排除。Vi抗原又稱表面抗原，目前已知的存在Vi抗原的沙門氏有傷寒、丙型副傷寒、都柏林沙門氏菌[7]。當Vi抗原存在于細菌表面，阻止了O多價血清的凝聚時，應挑取菌苔于1 mL的生理鹽水中制成濃度高的菌懸液，在沸水中煮沸 10～60 min后，再進行O多價血清凝聚實驗。

（3）多價H抗原。H抗原又稱鞭毛抗原，大部分沙門氏都周身鞭毛，H抗原發育不良會造成H抗原血清不凝集，國標中采用接種菌體至半固體中做純培育，使鞭毛生長良好后再進行H抗原的試驗，由于血平板營養更豐富，本人通過多次試驗發現點種哥倫比亞血平板的方法，其鞭毛生長更加迅速旺盛，試驗效果更好。