全自動固相萃取-高效液相色譜法測定 醬鹵肉制品中胭脂紅的優化

◎ 蘇駿敏，沈昌瑩，張樹權

（東莞市食品藥品檢驗所，廣東 東莞 523808）

胭脂紅，又稱為酸性紅18、麗春紅4R，屬于合成著色劑，是一種被廣泛應用于食品工業中的單偶氮類人工合成色素[1]。人工合成色素與天然色素相比，具有著色能力強、穩定性好、成本低廉等優勢[2]。因此醬鹵肉制品在生產過程中有時會加入胭脂紅，以改善食品的色澤外觀，提高人們的食欲。但人工合成色素具有慢性毒性，在人體內蓄積分解后，有可能會轉化成致癌物質，且具有致畸性，長期過量使用危害人體健康[3-8]。同時，不法分子可能通過使用胭脂紅掩蓋變質肉等不良原料的外觀[9-10]。依據《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）[11]的規定，醬鹵肉制品中禁止使用胭脂紅，但仍存在不少不法商販在醬鹵肉制品生產過程中超范圍使用胭脂紅。目前，測定食品中胭脂紅的國標檢測方法有 GB/T 9695.6—2008[12]和GB 5009.35—2016[13]，該檢測方法前處理操作步驟煩瑣，均采用聚酰胺吸附法，實驗過程中有大量目標物損失，且對于油脂含量較高的樣品在檢測中易出現提取率低、凈化效果不佳、回收率較低等問題，不適用于大批量樣品的檢測。

本研究在現行國標檢測方法基礎上，對除脂、提取和凈化步驟進行改進，采用固相萃取法替代國標方法中的聚酰胺粉末吸附法，通過全自動固相萃取儀，自動完成固相萃取凈化全過程，以期為醬鹵肉制品中胭脂紅的測定提供一種快捷、靈敏度高的檢測 方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀（配備1240-元素光電二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司）；Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀（廈門睿科儀器有限公司）；3K 15高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；HS 501數顯型振蕩搖床（德國IKA公司）；Evatros氮吹濃縮儀（Goojung公司）；METTLER TOLEDO SevenExcellence型數字式精密酸度計（美國梅特勒公司）。

甲醇（色譜純，德國Merck公司）；無水乙醇、一水合檸檬酸（分析純，廣州化學試劑廠）；氨水（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；乙酸銨（色譜純，山東西亞化學股份有限公司）；甲酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；Cleanert PWAX固相萃取柱（6 mL，500 mg）、Cleanert PA聚酰胺固相萃取柱（6 mL，1 g）（北京艾杰爾科技公司）；Oasis WAX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、Oasis HLB（200 mg，6 mL）（美國Waters公司）；Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid（美國安捷倫科技有限公司）；0.45 μm水系濾膜（深圳逗點生物技術有限公司）；實驗室用水為Milli-Q超純水；胭脂紅標準品（批號22001，濃度0.500 mg·mL-1，中國計量科學研究院）。

樣品來自廣東省內生產企業生產環節抽樣。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

甲醇-甲酸溶液（3+2，體積比）：量取甲醇30 mL， 甲酸20 mL，混勻；15%氨水甲醇溶液：取15 mL氨水，用甲醇定容至100 mL；20%乙醇-氨溶液：量取20 mL氨水、70 mL無水乙醇、10 mL水，混勻；檸檬酸溶液：稱取20 g 檸檬酸，加水定容至100 mL；水（pH=6.0）：取100 mL水，用檸檬酸溶液調節pH至6.0；水（pH=4.0）：取100 mL水，用檸檬酸溶液調節pH至4.0。

1.2.2 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.001 g）粉碎均勻的醬鹵肉制品于50 mL離心管中，加入20%乙醇-氨溶液20 mL，旋緊蓋子，渦旋1 min，置于振蕩搖床上振蕩提取20 min 后，于-18 ℃冷凍30 min，8 000 r·min-1、4 ℃離心5 min， 上清液轉移至50 mL容量瓶中，再分別用15 mL、10 mL提取液重復提取2次，合并提取液，用乙醇-氨溶液定容至刻度。精密移取上清液10 mL，70 ℃氮吹濃縮至約2 mL，混勻后待凈化。

全自動固相萃取：依次用6 mL甲醇、6 mL水（pH=6.0）活化后，上樣，再用6 mL水（pH=4.0）、6 mL甲醇-甲酸（3+2），6 mL水（pH=6.0）淋洗，6 mL 15%氨水甲醇溶液洗脫。收集洗脫液，70 ℃氮吹至近干，殘渣用1 mL水溶解，經0.45 μm水系濾膜過濾后進高效液相色譜儀檢測分析。

1.2.3 儀器條件

（1）全自動固相萃取儀凈化程序詳見表1。

表1 全自動固相萃取儀凈化程序表

（2）液相色譜儀條件。色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相：A甲醇；B 0.02 mol·L-1乙酸銨溶液；梯度洗脫程序見表2；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長 508 nm。

表2 流動相洗脫梯度表

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

2.1.1 除脂條件的優化

醬鹵肉制品中含有大量的油脂，其對胭脂紅的提取存在較大影響，且易在凈化時堵塞固相萃取柱，因此在前處理提取過程中需去除脂肪。根據文獻[14]，QuEChERS EMR-Lipid可用于去除樣品基質中脂質的干擾，本文采用冷凍去脂（-18 ℃）、QuEChERS方法、石油醚除脂方法進行比較分析，考察3種除脂方法對醬鹵肉制品中胭脂紅提取的影響，提取率結果見 表3。

表3 不同除脂方法下胭脂紅的提取率表（n=3）

根據表3結果可知，經過冷凍去脂的醬鹵肉制品的胭脂紅提取率最高，QuEChERS方法的提取率最低。同時，分別比較了-18 ℃、4 ℃、常溫下離心對樣品中胭脂紅提取率的影響，發現在4 ℃離心的提取率最高。因此，選用冷凍去脂并在4 ℃離心作為醬鹵肉制品的去脂方法。

2.1.2 提取液氨水濃度的選擇

胭脂紅極性較強，易溶于水，難溶于乙醇。用水作為提取液，提取效果不理想，難以提取出與蛋白質結合的胭脂紅，且提取液中雜質較多。因此，分別用10%、20%、30%、40%和50%氨水溶液作為提取液，考察氨水濃度對醬鹵肉制品中胭脂紅提取效率的影響，結果見圖1。

由圖1可知，當氨水濃度為20%時，胭脂紅的提取效率最高。當氨水濃度在20%～50%時，隨著氨水濃度的升高，提取液愈發渾濁，這是由于氨水濃度過高導致樣品中的脂肪游離進提取液。氨水濃度過高不利于后續冷凍除脂，導致提取液中干擾增多，提取效率下降。因此最終選擇20%氨水溶液，即為無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）作為提取液。

圖1 不同濃度氨水下胭脂紅的平均提取效率圖（n=3）

2.1.3 固相萃取柱凈化條件的優化

本研究參考了國標和相關文獻[12-17]，研究考察胭脂紅標準溶液用Cleanert PWAX（500 mg，6 mL）、Cleanert PA（1 g，6 mL）、Oasis WAX（150 mg，6 mL）和Oasis HLB（200 mg，6 mL）固相萃取柱在不同淋洗和洗脫條件下的回收率，結果見表4。

表4 不同固相萃取柱在不同淋洗、洗脫條件下的回收率表

由表4可看出，Cleanert PWAX固相萃取柱回收率在0%～70%，Oasis HLB固相萃取柱回收率在19%～30%，且PWAX柱使用較低濃度的氨水甲醇溶液不能將胭脂紅從柱中洗脫出來，HLB柱對胭脂紅的吸附效果不佳，很難保留。Oasis WAX柱在使用水和甲醇淋洗時回收率較好，能達到70%以上，隨著氨水甲醇洗脫液濃度的增加，回收率逐漸上升。Cleanert PA萃取柱在使用甲醇-甲酸（3∶2）作為淋洗液，15%氨水甲醇洗脫時，效果較好，回收率可達到90%以上。

對比胭脂紅樣品加標提取液過柱凈化效果情況，結果如圖2所示。結果表明，經Cleanert PA柱凈化后胭脂紅的回收率最高，Oasis HLB柱回收率最低。綜合考慮到胭脂紅的回收率，以及為降低廢液污染和節約成本，最終選擇水（pH=4.0）、甲醇-甲酸（3∶2）、甲醇作為淋洗液，15%氨水甲醇作為洗脫液，Cleanert PA作為凈化用固相萃取柱。

圖2 不同固相萃取柱對胭脂紅回收率的影響圖（n=3）

2.1.4 氮吹濃縮溫度的優化

將洗脫液收集于10 mL試管中，分別考察在55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃下進行氮吹的胭脂紅的回收率。結果表明，氮吹溫度對胭脂紅的回收率影響不明顯，考慮到在55 ℃～65 ℃下氮吹耗時較長，因此確定氮吹溫度為70 ℃。

2.1.5 針式過濾器的選擇

洗脫液經氮吹至近干后，加水定容至1 mL，過 0.45 μm濾膜后上機檢測。考察對比北京振翔科技有限公司的親水PTFE濾頭、津騰的PTFE濾頭和深圳逗點生物技術有限公司的PES濾頭、上海安譜實驗科技股份有限公司的Nylon濾頭。上機結果顯示，經PES濾頭過濾的待測液中胭脂紅含量較高，原因可能是Nylon和PES膜對胭脂紅有所吸附[17-18]。故選用深圳逗點生物技術有限公司的PES濾頭用于洗脫液的過濾。

2.2 標準曲線線性范圍及方法檢出限

準確吸取適量胭脂紅標準物質適量，用水稀釋成濃度為50.0 μg·mL-1的貯備液，再用水將貯備液依次稀釋成濃度為0.01 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1和20.00 μg·mL-1的標準工作溶液，進樣量為10 μL，以胭脂紅質量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，建立標準校準曲線。胭脂紅質量濃度在0.01～50.00 μg·mL-1線性良好，相關系數≥0.999，斜率為0.827 3。按照本試驗前處理方法對加標樣品進行處理，以色譜峰3倍信噪比 （S/N=3）求得方法檢出限（Limits of Detection，LOD），本方法胭脂紅的方法檢出限為0.02 mg·kg-1，低于國標方法GB/T 9695.6—2008，滿足試驗要求。

2.3 加標回收率和精密度

平行稱取18份醬鹵肉空白基質樣品，分別在 0.1 mg·kg-1、5.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-13個水平下進行加標回收試驗，每個濃度加標樣品重復測定6次，加標回收率結果見表5。由表5可知，胭脂紅在3個添加水平的回收率為85.2%～94.7%，滿足GB/T 27404—2008[19]附錄F.1中要求被測組分含量在0.1～1.0 mg·kg-1以及1～100 mg·kg-1，回收率分別在80%～110%、90%～110%的要求。與國標方法GB/T 9695.6—2008回收率60%～80%相比較，本方法回收率顯著提升，且精密度良好，能滿足檢測的要求。

表5 加標回收率和精密度表（n=6）

3 結論與討論

本研究采用無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）作為提取液，通過冷凍除脂、低溫離心，使用聚酰胺固相萃取柱，采用固相萃取法替代國標中的聚酰胺吸附法[20]，并且全過程無需對提取液調節pH值，氮吹后定容即可上機，適用于富含油脂的醬鹵肉制品中的胭脂紅的測定。同時，采用全自動固相萃取儀進行凈化，無需人工干預，自動完成固相萃取柱的活化、上樣、淋洗、洗脫和收集等全過程。采用本方法進行測定，回收率與相關文獻方法比較有較大的提升，方法檢出限低于國家標準方法GB/T 9695.6—2008。同時，本方法前處理方便快捷，節省了提取凈化用試劑的消耗，降低污染，能滿足大批量醬鹵肉制品中胭脂紅的日常檢測。