HPLC-MS/MS法測定魚肉中19種喹諾酮類抗生素的殘留研究

◎ 李盛安，何國成，陳 楠，張益文，劉正華

（1.中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437；2.中山市農產品質量安全檢驗所，廣東 中山 528437；3.中山市三鄉鎮農產品質量安全檢測站，廣東 中山 528463；4.中山市小欖鎮食品綜合快檢中心，廣東 中山 528415）

喹諾酮類（Quinolones，QNs）抗生素長期在我國南方多個省份淡水養殖行業中使用。近30年來，隨著我國淡水養殖規模的不斷擴大，水產養殖周期、密度增加，由細菌、真菌引發的各種魚類疾病頻繁出現，給養殖戶帶來了嚴重的經濟損失[1-2]。QNs抗生素與其他抗生素（如頭孢類、四環素等）相比具有價格低廉、抗菌力強、低毒副作用和易降解等優點，加上氯霉素、紅霉素等藥物前后被國家相關部門禁用，使得QNs抗生素被長期廣泛地應用于魚類細菌性疾病的防治[3]。有研究表明，使用抗生素不僅可以有效抑制致病菌的生長，使得致病菌產生抗性，還會影響微生物群落多樣性，對其他細菌的活性及生長產生不同程度的影響。例如，非致病菌受到不同程度抑制后，很可能影響水生動物體內及養殖水環境的微生物生態平衡，導致水環境日益惡化，引發新的疾病。水產養殖環境中殘留的QNs抗生素不僅影響水生動物生長，還會隨養殖尾水排放進入下游流域對水環境產生影響。

常見的檢測QNs抗生素的方法有高效毛細管電泳法[4]、薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[6]和液相色譜串聯質譜法。魚肉中含有蛋白質、脂肪等各種營養成分，多以大分子存在。采用色譜法檢測抗生素殘留時，由于魚肉樣品基質較為復雜，會影響色譜峰的出峰時間及峰型，從而影響抗生素殘留的定性、定量，容易出現假陽性；采用LC-MS/MS檢測魚肉中QNs抗生素殘留，多重反應監測模式通過采集特征離子數據，結合色譜峰保留時間進行目標化合物的定性、定量，提高了檢測方法的準確性及靈敏度[7-9]。據統計， 2020年中山市水產養殖面積約為20 666 hm2，年產量約35萬t，主要以淡水池塘養殖四大家魚為主。中山市是廣東省水產養殖大市，市內有多家供港澳食用農產品的生產基地，其產品在港澳市場深受市民喜愛，中山區域承擔著港澳淡水魚水產品供應的重任。因此，在中山市開展魚肉中QNs抗生素殘留檢測具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高速冷凍離心機（SIGMA公司）；勻漿機（IKA公司）；電子天平（Precisa公司）；MULTIVAPTM118 氮吹儀（Organomation公司）；XW-80A旋渦混合器（上海精科）；R-210旋轉蒸發儀（BUCHI公司）；A10超純水純化系統（Millipore公司）；0.22 μm有機濾膜（天津津騰）；1200-G6495液相色譜串聯質譜聯用儀（Agilent公司）。

甲醇、甲酸均為色譜純（Merck公司）；麻保沙星、吡哌酸、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、恩諾沙星、環丙沙星、洛美沙星、單諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、奧索利酸、西諾沙星、氟甲喹、萘啶酸、奧比沙星、氟羅沙星和司帕沙星（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 溶液配制

分別稱取適量上述標準品，先用甲醇溶解后定容于100 mL容量瓶中，此時各組分單標儲備液濃度為 1 000 mg·L-1，于4 ℃下避光保存。再將各組分單標儲備液稀釋后配成混合標準溶液，備用。

1.3 色譜質譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；進樣量：1 μL；柱溫：40 ℃；流動相：A為0.1%的甲酸水溶液，B為甲醇溶液，流速為0.4 mL·min-1；分離19種QNs抗生素的流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件表

（2）質譜條件。電離方式：ESI+；干燥氣溫度：350 ℃；毛細管電壓：4.0 kV；干燥氣流速：14 L·min-1；霧化器壓力：30 psi；監測模式：多反應監測；各抗生素組分離子對及碎裂電壓、碰撞能量及保留時間見表2。

表2 19種QNs抗生素測定的質譜測定條件參數表

1.4 樣品處理

活魚現宰去鱗腮，取魚肉部分清洗干凈后晾干表面水分，魚肉攪碎后稱取5 g魚肉樣品置于50 mL具塞離心管中，加入2 mL EDTA-Macllvaine緩沖溶液，渦旋混合30 s，避光放置10 min。往具塞離心管中加入20 mL 1.0%甲酸乙腈，8 000 r·min-1均質2 min，再加入10 g無水Na2SO4，離心管擰緊蓋子渦旋混合 60 s，設置離心機溫度為-4 ℃，以10 000 r·min-1離心3 min，將上清液倒入旋轉蒸發瓶中。再往具塞離心管加入20 mL 1.0%甲酸乙腈，渦旋混合30 s，重復提取一次，將上述兩次提取液合并，設置溫度為50 ℃、真空度為80 kPa，調整適當轉速將提取液在水浴旋轉蒸發儀上濃縮至近干，用2 mL 20%甲醇溶液解殘渣，再加入2 mL正己烷渦旋混合30 s，將旋轉蒸發瓶中的溶液吸出置于離心管中，再在-4 ℃，以10 000 r·min-1離心3 min，吸取下清液過0.22 μm濾膜，上機待測。同時，做樣品空白試驗。

1.5 標準曲線繪制

使用基質配制標準溶液建立標準曲線對樣品進行外標法定量，可以有效消除樣品基質對抗生素組分的干擾。本文采用不含QNs抗生素的魚肉空白基質溶液稀釋配制標準品，濃度分別為1 μg·L-1、2 μg·L-1、 5 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1的系列QNs基質配制混合標準溶液，混標溶液過 0.22 μm濾膜，上機待測。以各抗生素組分定量離子色譜峰面積為縱坐標，相應混標溶液的濃度為橫坐標計算編制標準曲線。同時，做基質空白試驗。

2 結果與分析

2.1 提取液的選擇

考慮到魚肉中含有大量的蛋白質及脂肪等大分子，在提取QNs抗生素時干擾物質較多。實驗分別選取氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和西諾沙星等5種具有代表性的QNs抗生素，按照本文1.4樣品處理方法，在稱取5 g魚肉樣品后加入上述5種QNs抗生素的混合標準溶液，添加QNs抗生素混合標準溶液后擰緊蓋子后放置于4 ℃條件下過夜，各組分的濃度分別為20 ng·mg-1、50 ng·mg-1，同時進行3個樣品的平行實驗。對比乙腈、乙酸乙酯、1.0%甲酸甲醇和1.0%甲酸乙腈溶液4種提取液，分析上述4種提取液的加標回收率，發現1.0%甲酸乙腈溶液提取效果相對優于其他提取液。最終本文采用了1.0%甲酸乙腈溶液為提取液，結果如表3所示。

表3 不同提取液對QNs抗生素的回收率表

2.2 標準曲線及檢出限

在實驗方法1.5標準曲線繪制有基礎上，以各抗生素組分的特征離子色譜峰3倍信噪比（S/N＞3）為方法檢出限，標準曲線、相關系數R2及各組分檢出限見表4。19種QNs抗生素在1～200 μg·L-1呈良好的線性關系，相關系數R2均大于0.998 0，能滿足日常水產品中19種QNs抗生素殘留監測的需要。

表4 19種QNs抗生素的標準曲線、相關系數及檢出限表

2.3 方法回收率和精密度

稱取不含QNs抗生素的魚肉于50 mL具塞離心管中，添加10 ng·mg-1、20 ng·mg-1、60 ng·mg-1的19種QNs抗生素進行回收率實驗，添加QNs抗生素混合標準溶液后擰緊蓋子后放置于4 ℃條件下過夜，同時進行3個樣品的平行實驗，重復3次。由表5可知， 19種QNs抗生素的加標回收率在69.23%～96.28%，相對標準偏差在6.28%～9.86%，方法具有較好的精密度和回收率。

表5 魚肉中19種QNs抗生素的平均加標回收率與精密度表

2.4 實際樣品的測定

采用本文建立的檢測方法對中山市水產養殖漁塘中35個魚肉樣品（其中烏鱧7個、鳙魚9個、羅非魚9個以及草魚10個）進行測定，結果表明19種QNs抗生素均未檢出。

3 結論

本文建立了高效液相色譜串聯質譜法測定魚肉中多種QNs抗生素殘留的監測方法。該方法具有分析時間短、操作簡單、定性準確性高及檢出限低等優點。標準《水產品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（農業部1077號公告—1—2008）中包括了15種喹諾酮類的檢測方法，但標準的分析時間較長。本文對前處理提取液進行優化，方法具有較好的精密度和回收率，能滿足日常大批量監測的需要。