廣西煙草一種斑枯病新病原菌的鑒定

范東升，張得平，藍達愉，袁高慶，盧燕回*

1.中國煙草總公司廣西壯族自治區公司，南寧市青秀區茶花園路25號 530022 2.廣西大學農學院，南寧市西鄉塘區大學東路100號 530004

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國主要的經濟作物之一，生長過程中常受多種病害的影響，導致煙葉產量與品質下降。按照病害發生部位歸類，由主要侵染植株葉片的病原引起的病害統稱為葉斑病。煙草葉斑病種類繁多，發生普遍，常見的葉斑病有煙草赤星病、煙草蛙眼病、煙草靶斑病、煙草棒孢霉葉斑病和煙草野火病等［1］。近年來，隨著氣候環境、耕作制度、栽培條件和栽培品種的改變，不斷有新的煙草葉斑病種類或已知煙草葉斑病的新記錄病原出現［2-6］。祖燕青等［4］通過形態學和rRNA-ITS序列分析，明確引起河南省煙區煙草赤星病的病原菌種類有鏈格孢（Alternaria alternata）、長柄鏈格孢（A.longipes）和鴨梨鏈格孢（A.yaliinficiens）3種，其中鴨梨鏈格孢是引起煙草赤星病的首次報道。Sun等［5］通過形態學和rRNA-ITS序列分析將引起貴州煙草靶斑病的病原菌鑒定為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-6，該病原菌是引起煙草靶斑病的新的立枯絲核菌菌絲融合群。Wang等［6］于2017年在貴州正安縣發現一種未知的煙草葉斑病，將其命名為煙草斑枯病。該病病斑呈褐色，形狀不規則，與健康組織之間有明顯的黃色暈圈，發病嚴重時多個病斑可融合成片，導致整張葉片枯萎，在近3萬平方米的發病范圍內發病率達30%。隨后通過開展病原菌的形態學鑒定、rRNA-ITS和TUB2序列分析，將引起該病害的病原菌鑒定為瓜擬多隔孢（Stagonosporopsis cucurbitacearum），這是煙草斑枯病的首次報道。2021年3月，廣西百色市田林縣八渡鄉局部煙田的K326煙草品種上也出現了一種與煙草斑枯病癥狀類似的病害，主要危害團棵期煙株的中下部葉片，發病面積約2 000 m2，田間病株率約8%。為明確該病害的病原，于發病煙田采集不同病株上的典型發病葉片，通過組織分離法進行病原菌的分離，按照柯赫氏法則驗證病原菌的致病性，將病原菌的形態鑒定和分子鑒定相結合，確定病原菌的分類地位，以期為該病害的科學防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于病原菌分離的煙草病葉標樣采集于廣西百色市田林縣八渡鄉發病煙田的病株，置于封口袋中，保存在4℃冰箱中備用。健康煙草植株來自廣西大學農學院溫室，品種為K326，用于分離菌株的致病性測定。

1.2 病害癥狀觀察與病原菌的分離純化

觀察廣西百色市田林縣八渡鄉煙田病害發生的煙草生育期、危害部位、病斑形狀和顏色、病斑大小、病斑上有無病征等癥狀特點，并與已知煙草病害癥狀進行對比。

采集病葉，采用常規組織分離法［7］分離病原菌，具體步驟為：剪取病健交界處葉片組織并用75%（體積分數）酒精表面消毒30 s，再用0.1%（質量分數）氯化汞溶液消毒30 s，無菌水沖洗3次。用無菌剪刀將消毒后的病葉組織塊剪成5 mm×5 mm的小塊，移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，置于28℃恒溫培養箱培養2～3 d，待菌絲長出后，在無菌條件下用接種針挑取菌落邊緣的菌絲塊，轉移至新的PDA培養基上進行純化培養5 d，再用PDA斜面試管培養7 d后置于4℃冰箱中保存備用。

1.3 分離菌株的致病性測定

將保存的代表性菌株轉移至PDA平板上，在28℃恒溫培養箱中培養5 d，按照柯赫氏法則對分離菌株的致病性進行測定［8］。采用菌絲塊接種法［9］對健康煙草葉片進行有傷和無傷接種。選取5～6葉期煙株中下部葉片，葉片左半邊的接種部位用無菌針頭刺3個小孔，右半邊無傷處理。用打孔器取直徑為5 mm的菌絲塊，將菌絲面朝下貼于葉片上，每張葉片接種4個菌絲塊，然后在菌絲塊上覆蓋無菌水濕潤后的棉花薄層，并套袋保濕。每個處理接種3張葉片，重復3次。對照組接種PDA培養基塊。將接種后的煙株置于28℃光照培養箱中，觀察并記錄發病情況。待葉片發病后，從發病部位再次分離菌株進行鑒定，以完成柯赫氏法則驗證。

1.4 病原菌的形態特征觀察

在28℃和12 h光照/12 h黑暗條件下將菌株分別在PDA和V8培養基中培養，觀察菌落形態。待形成子實體后，在尼康Eclipse 80i顯微鏡（日本株式會社尼康公司）下鏡檢子實體和分生孢子形態特征，并隨機挑選30個子實體和50個分生孢子測量其大小。

1.5 病原菌的rRNA-ITS和TUB2序列分析

將純化后的菌株按照真菌基因組DNA提取試劑盒（杭州博日科技股份有限公司）說明書的方法提取基因組DNA。使用通用引物組ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b分別擴增ITS、TUB2序列［10］。PCR擴增體系（25μL）：Taq PCR MasterMix 12.5μL，上下游引物各1μL，模板DNA 1μL，用ddH2O將反應體系補至25μL。PCR反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸60 s，30個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。取5μL PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，觀察到單一條帶后，委托上海生物工程股份有限公司對擴增產物進行測序。使用NCBI網站的Blastn在線工具對序列進行比對分析，在GenBank數據庫中下載Aveskamp等［11］提供的參考菌株基因序列，與本研究中菌株的序列比對剪切后按ITS-TUB2的順序進行拼接，利用MEGA 6.0軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀描述及病原菌的分離純化

經田間觀察，于廣西百色市田林縣新發現的煙草葉斑病主要危害團棵期的中下部煙葉，發病初期時葉片上呈現褐色小斑點且黃暈明顯，然后擴展形成橢圓形或不規則形病斑，大小不一，病斑邊緣深褐色，病健交界清晰，多個病斑可融合成片，導致葉片枯黃脫落（圖1A、圖1B）。該病癥狀與Wang等［6］報道的煙草斑枯病癥狀相似。從典型發病煙葉的病健交界處分離獲得多株菌落特征一致的菌株，經純化培養后，選取代表性菌株NL-2-1進行后續致病性測定和鑒定。

2.2 病原菌的致病性測定

按照柯赫氏法則測定代表性菌株NL-2-1的致病性。結果顯示，接種健康煙草葉片3 d后，接種部位邊緣呈黃色病變，且從有傷接種處開始變褐，病斑逐漸擴展，7 d后發病部位嚴重變褐壞死，病健交界處有明顯黃暈，有傷接種病斑擴展更快（圖1C），空白對照葉片未發病（圖1D）。

圖1 煙草斑枯病癥狀及菌株NL-2-1的致病性測定Fig.1 Symptoms of tobacco spot blight and pathogenicity determination of strain NL-2-1

從接種發病的煙葉中再分離得到的病菌與田間發病煙葉中分離的菌株NL-2-1形態一致，證明菌株NL-2-1對煙草葉片具有致病性，是引起廣西煙草斑枯病的病原菌。

2.3 病原菌的形態特征

菌株NL-2-1在PDA培養基中氣生菌絲不發達，菌落初期呈白色，隨著培養時間的延長逐漸變為灰白色，未見產孢（圖2A）。在V8培養基中培養約10 d能形成小黑點，為該菌株形成的分生孢子器。分生孢子器近球形，直徑70～150μm，多埋生，在培養基中集中生長，形成約45°的扇形產孢區域（圖2B、圖2C）。擠壓小黑點鏡檢，能觀察到大量的分生孢子。分生孢子單胞，無色，呈橢圓形，大小為4.8～12.3μm×2.1～3.8μm（平均大小為7.1μm×2.7μm）（圖2D），與Bracale等［12］描述的Stagonosporopsis屬形態特征相近。

圖2 菌株NL-2-1的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of strain NL-2-1

2.4 病原菌的rRNA-ITS和TUB2序列分析

經測序，菌株NL-2-1的rRNA-ITS和TUB2序列分別為536 bp（NCBI登錄號為OM062578）和336 bp（NCBI登錄號為OM240593）。Blastn比對結果顯示，其與Stagonosporopsis caricae的相似度分別為99.61%（ITS，MH860977）和100%（TUB，MK255067）。選取Aveskamp等［11］提供的相關菌株Stagonosporopsis caricae，S.cucurbitacearum，S.heliopsidis，S.andigena，S.dorenboschii的rRNA-ITS和TUB2序列聯合建立系統發育樹進行系統發育分析。結果顯示，菌株NL-2-1與Stagonosporopsis caricae親緣關系最近，以100%的自展支持率聚為同一個分支（圖3）。結合形態學特征及分子鑒定結果，確定引起廣西煙草斑枯病的病原菌為Stagonosporopsis caricae。

圖3 菌株NL-2-1的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain NL-2-1

3 討論

根據病原菌的致病性測定、形態特征觀察、rRNA-ITS和TUB2序列分析結果，明確了廣西煙草斑枯病的病原菌為Stagonosporopsis caricae，這是該病原菌在煙草上發生危害的首次報道。Stagonosporopsis屬之前被歸屬于殼二孢屬Ascochyta，因其偶爾形成多隔分生孢子（Stagonospora-like）而被劃分為新屬，與莖點霉屬Phoma親緣關系相近，所以Stagonosporopsis caricae也曾命名為Ascochyta caricae-papayae Tarr.和Phoma caricae-papayae（Tarr.）Punith.［13］。2010年，Aveskamp等［11］根據LSU（28S large subunit of the nrDNA）、rRNA-ITS和TUB2（beta-tubulin 2 gene）多基因序列分析，研究了莖點霉屬Phoma和格孢腔菌目Pleosporales內相關屬的遺傳進化關系，并將該病原菌重新命名為Stagonosporopsis caricae（Sydow & P.Sydow）Aveskamp，Gruyter & Verkley。2021年，何蘇琴等［14］將Stagonosporopsis caricae的中文名命名為木瓜擬多隔孢，該病原菌可引起番木瓜（Carica papaya）莖干腐爛。

Stagonosporopsis caricae除了是侵染番木瓜科（Caricaceae）作物的重要病原菌，與另外兩個近緣種S.cucurbitacearum和S.citrulli一樣還可引起西瓜（Citrullus lanatus）、黃 瓜（Cucumis sativus）、甜 瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbita moschata）和苦瓜（Momordica charantia）等多種葫蘆科（Cucurbitaceae）作物的蔓枯病和葉疫病［15-17］。發生在貴州的煙草斑枯病的病原菌為S.cucurbitacearum，本研究中鑒定出引起廣西煙草斑枯病的病原菌為S.caricae，進一步豐富了該病原菌的寄主范圍和煙草斑枯病的病原菌種類。目前該病害在廣西田林縣煙區局部田塊輕度發生，后期通過噴施廣譜殺菌劑控制了病情的擴展。后續應持續關注該病害的危害程度、分布范圍和發病規律，以避免其對當地煙葉生產造成不利影響。

4 結論

明確了廣西煙草新記錄病害為煙草斑枯病，該病在煙草團棵期即可危害中下部煙葉，導致葉片提前枯黃脫落。通過致病性測定、形態學觀察、rRNA-ITS與TUB2基因序列聯合系統發育樹分析，鑒定出引起廣西煙草斑枯病的病原菌為木瓜擬多隔孢（Stagonosporopsis caricae），是該病原菌在煙草上發生危害的首次報道，且木瓜擬多隔孢與貴州報道的煙草斑枯病病原菌同屬不同種，表明將rRNA-ITS和TUB2基因序列聯合分析，可有效區分Stagonosporopsis屬的不同種類。