外源酶制劑對雪茄茄芯煙葉化學成分和感官品質的影響

鄭霖霖，趙亮，蔡興華，段旺軍，陳震，張勇剛，時向東*

1.河南農業大學煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州市金水區農業路63號 450002 2.浙江中煙工業有限責任公司技術中心，杭州市西湖區科海路118號 310024 3.四川中煙工業有限責任公司，成都市成龍大道一段56號 610066

傳統手工卷制的雪茄由茄衣、茄套和茄芯煙葉組成，其中茄芯為雪茄的主要部分，決定著雪茄吸食時的主流風味特征［1］。除栽培和調制等技術之外，發酵也是提高雪茄茄芯煙葉品質的關鍵措施之一［2］。煙葉發酵分為一次發酵和二次發酵，其中一次發酵主要是促進煙葉內在成分的快速轉化，二次發酵主要是彌補初次發酵中的不足，使煙葉化學成分更加協調，提高煙葉品質［3］。前人研究表明，在雪茄煙葉發酵過程中添加微生物菌劑、酶制劑或其他發酵介質等可改善煙葉品質，提高煙葉工業可用性［4-6］。有研究發現酶在煙葉發酵過程中具有重要作用，酶可以催化煙葉中的某些物質分解或合成，進而提高煙葉化學成分協調性，改善煙葉吸食品質［7-8］。目前利用外源酶制劑改善煙葉品質的研究報道較多。寇明鈺等［9］研究發現，在雪茄茄芯煙葉發酵過程中添加蛋白酶可降低煙葉蛋白質含量，香氣質和燃燒性等得到明顯改善。阮祥穩等［10］試驗發現，利用纖維素酶和蛋白酶處理可縮短煙葉發酵周期，提高煙葉總糖含量，且香氣量明顯增加。胡捷等［11］研究表明，在煙葉發酵過程中添加氧化酶有利于降低煙葉淀粉含量，改善煙葉燃吸時的口感。夏炳樂等［12］研究認為，復合酶制劑處理的煙葉總氮和煙堿含量有所降低，香味物質總量增加，感官品質明顯提高。說明添加外源酶能明顯改善煙葉香氣和吸味，提高煙葉燃燒性，煙葉化學成分含量及比值趨于協調［13］。而目前的研究主要涉及烤煙及未發酵雪茄煙葉中添加外源酶制劑，在雪茄茄芯煙葉二次發酵中添加外源酶制劑的研究則較少。為此，基于四川什邡雪茄茄芯煙葉初次發酵后蛋白質含量較高、刺激性較大等特點，以初次發酵的德雪1號中部煙葉為研究對象，在二次發酵前添加不同濃度的植酸酶、纖維素酶、果膠酶和中性蛋白酶制劑，研究外源酶制劑對二次發酵雪茄茄芯煙葉化學成分和感官品質的影響，旨在為提高煙葉使用價值、改進雪茄茄芯煙葉的二次發酵工藝提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年在河南農業大學煙草行業煙草栽培重點實驗室進行，試驗材料為四川長城雪茄煙廠庫存的2020年產初次發酵后的德雪1號中部煙葉。試驗前先將煙葉回潮至含水率為23%左右，備用。試驗用外源酶試劑：植酸酶（50 000 U/g，山東隆科特酶制劑有限公司）；纖維素酶（10 000 U/g，上海麥克林生化科技有限公司）；果膠酶（30 000 U/g，上海麥克林生化科技有限公司）；中性蛋白酶（20 000 U/g，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 試驗設計

試驗設置添加4種外源酶處理，每種酶分別設置3個用量水平，以蒸餾水為對照，共13個處理，見表1。試驗前對煙葉進行回潮，煙葉含水率控制在26%±1%，而后用小型噴霧器（鄭州博祥生物科技有限公司）將配制好的酶制劑均勻噴灑在煙葉表面，對照為等量蒸餾水，將噴灑過的煙葉置于KBF 240恒溫恒濕柜（德國Binder公司）中進行二次發酵。發酵條件：溫度45℃，相對濕度80%，發酵時間15 d。每個處理設置3次重復。

表1 試驗設計Tab.1 Experimental design

1.3 測定項目及方法

1.3.1 化學成分測定

煙葉發酵結束后，采用半葉法，即取完整葉片的一半混合均勻后于45℃烘箱中干燥2 h，粉碎并過孔徑0.25 mm篩網（60目），采用AA3型連續流動化學分析儀（天津中通科技發展有限公司）參照煙草行業標準YC/T 159—2019［14］、YC/T 160—2002［15］、YC/T 162—2011［16］、YC/T 217—2007［17］、YC/T 161—2002［18］、YC/T 249—2008［19］測定總糖、還原糖、煙堿、氯離子、鉀離子、總氮和蛋白質含量（質量分數）。根據煙草行業標準YC/T 282—2009［20］測定煙葉中的氨基酸含量。

1.3.2 可用性評價

采用化學成分可用性指數（Chemical Components Usability Index，CCUI）進行化學成分評價［21］，依據隸屬度函數模型指數和法計算CCUI：

式中：j為參評指標；i為不同酶處理；f（x）為隸屬度函數；w為各參評指標的權重。

選取總糖、還原糖、煙堿、總氮、鉀離子、氯離子、氮堿比和鉀氯比8個指標作為評價各處理化學成分的可用性因子。參照文獻［22-23］選擇拋物線型（P型）作為總糖、還原糖、煙堿、總氮、氯離子和氮堿比的隸屬度函數，函數表達式為：

選擇S型作為鉀離子和鉀氯比的隸屬度函數，函數表達式為：

式中：x為各化學成分指標的實際數值；x1、x2、x3、x4分別代表各化學成分指標的下限臨界值、最優下限值、最優上限值和上限臨界值，取值參照古巴雪茄煙葉各化學成分指標的實測值以及文獻［24-27］確定，見表2。運用主成分分析法并結合專家意見，對樣品數據進行分析，計算得到各評價指標的權重值［28］。

表2 雪茄茄芯煙葉化學成分指標的隸屬函數類型、拐點值及權重Tab.2 Function types,inflection points and weights of chemical component indexes of tobacco leaves for cigar fillers

1.3.3 感官品質評價

將發酵后的另一半煙葉由同一人員手工卷制成長度110 mm，直徑14 mm的雪茄煙，在溫度18℃、相對濕度70%的恒溫恒濕柜中醇化養護4個月后供評吸使用。由國家煙草栽培生理生化研究基地組織6名具有行業感官評吸資質的評委完成評吸，采用湖北中煙工業有限責任公司三峽卷煙廠雪茄原料9分制評吸方法，對煙葉香氣質、香氣量、余味、雜氣、甜感、刺激性、燃燒性和灰色8個指標進行感官品質評價，并分別賦予18%、16%、16%、10%、10%、12%、10%和8%的權重，按照公式（4）計算總分，總分越高代表煙葉的感官品質越好。評價方法見表3。

表3 雪茄原料感官品質評價方法Tab.3 Evaluation methods for sensory quality of cigar raw materials

式中：T為感官品質評價得分；Pi為某單項指標權重；為某單項指標平均得分。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數據處理及繪圖；采用SPSS 22.0軟件進行差異顯著性檢驗（Duncan's法）。

2 結果與分析

2.1 外源酶制劑對雪茄茄芯煙葉常規化學成分及氨基酸含量的影響

由表4可知，與CK相比，T2和T3處理雪茄茄芯煙葉總糖和還原糖含量增加至適宜范圍內或接近適宜范圍，且糖含量隨著酶濃度的增加整體呈增加趨勢。而T1和T4處理煙葉總糖和還原糖含量與CK相比差異不顯著。噴施酶制劑后煙葉煙堿含量在2.00%～2.43%之間，較CK降低4.33%～21.26%。不同酶制劑均以120 U/g酶濃度處理煙葉煙堿含量最低，且T1A3處理與T2A3、T3A3、T4A3處理間差異顯著。與CK相比，T2處理煙葉總氮含量均下降至適宜范圍內，較CK降低3.85%～10.34%，且不同酶用量處理間差異顯著。T4處理煙葉總氮含量隨著酶用量的增加呈上升趨勢，以T4A3處理煙葉總氮含量最高，較對照顯著增加3.85%。T1和T3處理則相反，煙葉總氮含量隨著酶用量的增加逐漸降低，其中T1A3和T3A3處理煙葉總氮含量較CK顯著降低，且均處于適宜范圍內。與CK相比，不同酶制劑處理（T3A1除外）煙葉蛋白質含量均明顯降低，以T4A2處理最低，較CK降低13.66%。氨基酸含量則明顯增加，且T3和T4均以90 U/g酶用量的處理煙葉氨基酸含量最高，與CK相比提高17.57%和21.28%。不同外源酶處理煙葉中鉀含量較CK均增加至適宜范圍內，增幅為0.72%～13.77%。不同酶制劑同一酶用量條件下，T4處理煙葉鉀含量顯著高于其他處理。不同酶制劑處理煙葉氯含量之間無顯著差異，均處于或接近適宜范圍（0.60%～0.80%）內。

表4 不同外源酶處理對雪茄茄芯煙葉化學成分含量的影響①Tab.4 Effects of different exogenous enzyme treatments on contents of chemical components in tobacco leaves for cigar fillers

2.2 雪茄茄芯煙葉化學成分可用性評價

CCUI值越高，表明煙葉化學成分整體協調性越好，煙葉可用性較高［28］。由圖1可知，與CK相比，T2和T3處理雪茄茄芯煙葉CCUI值均有所增加，其中以T3A3處理煙葉CCUI值最高，較CK增加21.21%；T1A1、T1A2和T4A1處理煙葉CCUI值顯著增加，而T1A3、T4A2和T4A3處理則明顯降低，以T4A3處理的CCUI值最低，較CK降低13.64%。與CK相比，不同酶制劑中均以60 U/g酶用量處理的煙葉CCUI值顯著提高，比CK增加9.09%～21.21%。

圖1 不同外源酶處理雪茄茄芯煙葉化學成分可用性指數Fig.1 Usability indexes of chemical components in tobacco leaves for cigar fillers under different exogenous enzyme treatments

2.3 外源酶制劑對雪茄茄芯煙葉感官品質的影響

由表5可知，添加酶制劑進行二次發酵后，雪茄茄芯煙葉的感官品質評價總分均高于CK。但不同酶處理間存在一定差異。整體來看，T1A3處理的煙葉評吸總分最高，感官品質較好，表現為香氣質較好、香氣量充足、余味較舒適、雜氣微顯、刺激性微有、煙氣柔和細膩。T2A3處理次之，T1A1處理的煙葉感官品質評分最低，表現為刺激性較大、灰色偏黑。在同種酶處理下，評吸總分隨著酶用量的增加而增加，煙葉香氣質改善、香氣量增加、余味舒適、甜度明顯提高，雜氣和刺激性降低。因此，以T1A3和T2A3處理的效果最好，香氣和綜合品質均表現最優。

表5 不同外源酶處理雪茄茄芯煙葉的感官品質評價Tab.5 Sensory quality evaluation of tobacco leaves for cigar fillers under different exogenous enzyme treatments（分）

3 討論

煙葉化學成分是煙葉品質的內在表現，直接影響煙葉的感官品質［29］。本研究結果表明，纖維素酶和果膠酶處理可顯著增加二次發酵后雪茄茄芯煙葉總糖和還原糖含量，這與李國棟等［30］研究結果一致，其原因可能是纖維素酶與果膠酶屬于多糖水解酶，可水解纖維素和果膠等物質，進而增加了煙葉中可溶性總糖含量。此外，研究中還發現纖維素酶可顯著降低二次發酵后雪茄茄芯煙葉煙堿含量，這與吳薇［31］、陳洪等［32］的研究結果一致，可能是因為纖維素酶破壞了煙葉細胞壁結構，細胞的滲透阻力降低進而引起煙葉內含物質的滲出，煙堿含量相對降低［33］。添加中性蛋白酶進行二次發酵后，雪茄茄芯煙葉中總氮含量略有增加，蛋白質含量明顯降低，氨基酸含量明顯增加，這與王林等［34］研究的不同酶制劑對烤煙上部葉化學成分影響的結果一致，可能是由于中性蛋白酶本身也為蛋白質，經過酶解后煙葉中蛋白質氮含量降低，但總氮含量略有增加所致［35］。鉀、氯含量以及鉀氯比與雪茄煙葉燃燒性密切相關，燃燒性差的煙葉其內含物質無法充分分解，會產生令人不愉快的枯焦氣味。本研究中發現，添加外源酶制劑進行二次發酵后雪茄茄芯煙葉鉀含量明顯提高，鉀氯比有所增加，可能是因為添加外源酶制劑后，氨氣等氣體物質在二次發酵過程中大量逸出揮發導致干物質量降低。

煙葉各化學成分指標之間是相互影響、相互作用的，通過CCUI值可比較煙葉常規化學成分的協調性［36］。本研究結果表明，外源酶處理可提高二次發酵后雪茄茄芯煙葉CCUI值與感官品質評價總分，其中纖維素酶和果膠酶處理煙葉CCUI值與感官品質變化規律基本一致，均隨著酶用量的增加總體呈上升趨勢，與馬海燕［37］、樊文舉等［38］的研究結果一致，可能是由于外源酶促進了煙葉內部物質的合成、分解與轉化，進而改善煙葉化學成分的協調性，提高了煙葉感官品質。值得注意的是120 U/g植酸酶、90 U/g和120 U/g中性蛋白酶處理的煙葉CCUI值與感官品質評價出現了背離現象，其原因一方面是CCUI值受隸屬函數拐點值和各指標權重值的影響［22］，另一方面是較高用量酶制劑處理的煙葉香味前體物質降解轉化較為充分，進而提高了煙葉感官品質。因此，添加外源酶對二次發酵后雪茄茄芯煙葉香氣品質的影響仍需進一步深入研究。而有關組合酶（纖維素酶和中性蛋白酶、植酸酶和中性蛋白酶等）之間的相互作用及其對煙葉品質的影響方面也有待進一步試驗。

4 結論

在雪茄茄芯煙葉二次發酵前添加不同外源酶制劑后煙葉化學成分及感官品質存在明顯差異。添加120 U/g纖維素酶和120 U/g果膠酶可顯著提高二次發酵后雪茄茄芯煙葉總糖和還原糖含量，添加90 U/g植酸酶和90 U/g中性蛋白酶可顯著降低雪茄茄芯煙葉煙堿和蛋白質含量，提高氨基酸含量。同等酶用量條件下，纖維素酶與果膠酶對改善二次發酵后雪茄茄芯煙葉化學成分協調性的效果優于植酸酶和中性蛋白酶。同種酶制劑條件下，高用量酶處理提高煙葉感官品質的效果優于低用量酶處理。綜合考慮煙葉化學成分協調性、感官品質和實際應用成本，以120 U/g纖維素酶處理更有利于提高二次發酵后雪茄茄芯煙葉品質。