煙草DELLA基因家族的克隆與表達模式分析

蔡健宇，余婧，張景云，李翔宇，賈蒙驁，尹國英，葉定勇，薛曉兵，張盼，鄒頡，郭玉雙*

1.貴州省煙草科學研究院煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴陽市觀山湖區龍灘壩路29號 550081 2.浙江省寧波市寧海縣農業農村局，浙江省寧波市寧海縣桃源中路118號 315600 3.江西省農業科學院蔬菜花卉研究所，南昌市青云譜區南蓮路602號 330200 4.黑龍江省農業科學院作物資源研究所，哈爾濱市南崗區學府路368號 150030 5.貴州中醫藥大學藥學院，貴陽市花溪區大學城棟青南路 550030

煙草是我國重要的經濟作物之一，而赤霉素（Gibberellin,GA）是一種在煙草種植中被廣泛使用的植物激素，能夠影響煙草的株型、抗性和煙葉的質量［1-2］。DELLA蛋白在GA信號通路中為抑制效應因子，內源GA可誘導其降解并解除其抑制效應［3］。研究顯示，GA缺失時，DELLA-GFP融合蛋白在細胞核中富集；GA存在時，融合蛋白在核中的信號消失［4］，GA誘導的DELLA蛋白降解依賴于DELLA蛋白中的DELLA結構域［5］，缺失該結構域的DELLA蛋白在GA存在的情況下仍然穩定。此外，研究者們以模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）為研究對象，通過單突變或者多突變的方式逐個驗證DELLA蛋白序列中關鍵結構域的功能，逐步解析其在擬南芥生長發育過程中的多面調節作用［6-8］。目前，擬南芥中已發現了包括GAI在內的5個DELLA蛋白家族類似基因。除擬南芥外，其他植物中也相繼鑒定出了DELLA蛋白家族基因，包括水稻中的SLENDER RICE 1（SLR1）［9］、番茄中的PROCERA［10］、葡萄中的VvGAI1［11］、玉米中的DWARF8（D8）和DEARF9（D9）［12］等，且 鑒 定 出 的DELLA蛋白家族普遍N端有一個DELLA結構域，C端有一個GRAS結構域，且都是核定位［13］。

目前，擬南芥和一些其他模式植物中DELLA蛋白功能的研究較多［14-15］，如韓雨欣等［16］利用生物信息學方法從茶樹全基因組數據庫中進行了分析，推測茶樹DELLA基因廣泛參與了茶樹生長發育及非生物逆境脅迫的響應；陳英杰等［17］利用同源重組的方法，發現棉花DELLA蛋白GhGAI2b基因可能參與GA信號途徑進而抑制植物生長發育。然而，煙草中的相關研究還鮮見報道。因此，利用電子克隆的方法，將擬南芥DELLA蛋白的GAI基因序列在NCBI煙草EST數據庫中進行同源比對，結合RT-PCR和SMARTer RACE技術，在煙草K326基因組中克隆DELLA蛋白家族基因成員，并對它們的cDNA進行克隆。同時，結合生物信息學對煙草中DELLA蛋白基因的結構和進化等進行分析，在此基礎上通過熒光定量PCR和基因芯片技術對其組織特異性、時期特異性、非生物脅迫下的表達模式進行研究，旨在了解煙草DELLA蛋白的抗逆機制，為其生物學功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試煙草品種為K326（Nicotiana tabacum L.）。將K326種子進行消毒、浸種和催芽，在貴州省煙草科學研究院采用溫室漂浮盤播種。溫室溫度設為28℃，每天交替進行12 h光照/12 h黑暗處理。采用100 mg/L GA和10μmol/L脫落酸（Abscisic acid，ABA）分別噴灑三周齡苗葉面，于噴灑后第0、2、5、8、11和14 h取葉片組織。此外，分別對三周齡煙苗采用100 g/L PEG6000澆灌根部模擬干旱脅迫，低溫（4℃）處理、接種煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV），于處理后第7 d取葉片組織，用于檢測基因的非生物脅迫響應。上述材料取樣后液氮速凍，置于-80℃冰箱備用。

1.2 基因組DNA、RNA提取及cDNA合成

基因組DNA提取采用CTAB法［18］，總RNA提取采用TRIZOL Reagent試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］。cDNA的合成使用TransScript?

One-Step gDNA Remocal and cDNA Synthesis SuperMi試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），5’端擴增使用5’RACE試劑盒（日本TAKARA公司），具體操作步驟見試劑盒說明書。

1.3 煙草DELLA基因家族的鑒定及克隆

以擬南芥DELLA蛋白家族基因AtGAI全長cDNA序列（Gene Bank編號：NM-101361）為信息探針，在NCBI煙草EST數據庫中進行BLAST檢索，對檢索到的部分高同源性EST，利用軟件Geneious進行新的基因組裝配分析，獲得3條較長拼接序列，根據拼接序列設計引物，以煙草cDNA為模板進行PCR擴增，結合5’RACE獲得基因全長。膠回收純化后，將PCR產物與pMD-18T Vector連接，轉化大腸桿菌DH5α，陽性克隆送上海生物工程股份有限公司測序。

1.4 基因結構與序列分析

使用Interpro Scan軟件（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）分析編碼蛋白的相對分子質量、等電點等理化性質；采用最大似然法通過MEGA 5.0構建系統進化樹；使用Cluster W多序列比對工具進行氨基酸序列比對；使用SWISS-MODEL在線軟件（https://swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質三維結構預測；通過植物蛋白質亞細胞在線分析工具Plant mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）對DELLA蛋白進行亞細胞定位預測。

1.5 發育時期表達譜分析

根據中國煙草基因組數據庫中的煙草基因芯片數據，對煙草DELLA基因家族中的DELLA1～DELLA3基因在煙草不同發育時期的芯片數據進行了搜集整理，并用Origin軟件對數據進行分析制圖。

1.6 半定量PCR及熒光定量PCR分析

參照郭玉雙等［19］2015年建立的基因表達檢測方法進行RNA的提取、cDNA第一鏈的合成、半定量PCR及Real time RT-PCR擴增。以延伸因子基因EF-1-α（Elongation Factor 1-alpha 1 gene）作為Real time RT-PCR的內參。設計引物序列如表1所示。相對 表 達 量 采 用2-ΔΔCt［ΔΔCt=Ct（target gene）-Ct（internal reference gene）］法計算，用SPSS 22.0軟件進行統計分析。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

2 結果與分析

2.1 煙草DELLA基因家族的克隆

將擬南芥DELLA基因家族的序列在NCBI煙草EST數據庫中比對，獲得了部分煙草中與之同源度較高的EST序列，使用Geneious軟件將收集到的EST進行新的基因組裝配分析，發現可以組裝出3條長于1 400 bp的EST序列（圖1）。其中第一條序列（NtDELLA1）是由FG200921.1、FG177469、FG137259.1、EB442187、EB441042.1、EB439180和DV159588共7個序列信息組裝拼接而成，全長1 870 bp，且通過ORF分析發現有一個編碼570個氨基酸的通讀框；第二條序列（NtDELLA2）由FG166698.1、EB451523.1、EB451304.1 和FG172890.1共4個EST組裝拼接而成，全長1 413 bp，且通過ORF分析發現其有一個編碼404個氨基酸的開放閱讀框；第三條序列（NtDELLA3）由

圖1 煙草DELLA基因的拼接Fig.1 Assembly of tobacco DELLA genes

FG170978.1、FG167716.1、FG134302.1、FG165341.1、FG138336.1、FG166698.1和FG165403.1共7個序列信息拼接而成，全長1 954 bp，且通過ORF分析發現其有一個編碼390個氨基酸的開放閱讀框。對3個開放閱讀框對應的氨基酸序列進行結構域分析，發現DELLA蛋白家族均具有保守的DELLA基序和GRAS結構域，將拼接獲得的3個煙草基因分別命名為NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3。

以栽培煙草K326的cDNA為模板，根據獲得的3個基因開放閱讀框序列分別設計引物，進行PCR擴增，獲得NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3的CDS全長，結果如圖2所示。NtDELLA1基因CDS全長1 704 bp，編碼567個氨基酸；NtDELLA2基因全長1 764 bp，編 碼587個 氨 基 酸；NtDELLA3全 長 為1 692 bp，編碼563個氨基酸。

圖2 以煙草cDNA和基因組DNA為模板NtDELLAs的擴增結果Fig.2 Amplification results of NtDELLAs using tobacco cDNA and genomic DNA as templates

為明確NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3在基因組中的基因結構，以栽培煙草K326基因組DNA為模板進行擴增，結果表明這3個煙草DELLA蛋白家族基因均沒有內含子，這與擬南芥和水稻等模式植物中DELLA基因的結構一致。此外，NtDELLA1的基因組擴增條帶經過切膠測序后，發現測序結果中存在一個長1 229 bp的片段。序列比對結果顯示，該序列與NtDELLA1的CDS序列高度相似（相似度97%），但相比NtDELLA1其基因末端缺失約480 bp，此缺失導致其蛋白質序列的C端出現移碼并提前終止，產生一個截短的蛋白。進一步序列分析發現該基因具有完整的開放閱讀框，且其翻譯的蛋白質序列含有DELLA特征結構域，因此命名為NtDELLA4（圖3A）。同時，以基因組DNA和cDNA分別作為模板對NtDELLA4進行擴增，發現基因組中能擴增出NtDELLA4的條帶，但是cDNA中無法擴增（圖3B），這表明NtDELLA4很有可能由于結構缺失演化為一個不表達的假基因。

圖3 NtDELLA4和NtDELLA1蛋白結構比較Fig.3 Protein structures of NtDELLA4 and NtDELLA1

2.2 煙草DELLA蛋白的生物信息學分析

將NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3基因編碼的蛋白質氨基酸序列在EBI的蛋白結構特征在線分析軟件Interpro Scan中進行分析后，發現NtDELLA1蛋白全長為567個氨基酸，分子質量為62.287 kDa，等電點為4.94；NtDELLA2蛋白全長為587個氨基酸，分子質量為64.246 kDa，等電點為4.76；NtDELLA3蛋白全長為563個氨基酸，分子質量為62.172 kDa，等電點為4.61。

通過結構域分析，發現這3個蛋白的氨基酸序列有2個明顯的結構特征，包括N端的DELLA結構域和C端的GRAS特征結構域，可見這3個蛋白為典型的DELLA家族成員（圖4）。多重序列比對結果（圖5）顯示煙草DELLA蛋白含有2個DELLA家族的特征結構域（DELLA結構域和GRAS結構域），且N端的DELLA結構域含有高度保守的VHYNP基序。3個煙草的DELLA蛋白與擬南芥的該蛋白高度同源，故它們的作用機制可能相似。

圖4 3個煙草DELLA蛋白結構Fig.4 Structures of three tobacco DELLA proteins

圖5 NtDELLAs蛋白和其他物種NtDELLAs蛋白的氨基酸序列比對Fig.5 Amino acid sequence alignment of tobacco NtDELLAs and those of other plants

對煙草DELLA蛋白的氨基酸序列進行進化樹分析，結果發現NtDELLA1和水稻的OsGAI聚類在一起，親緣關系較近；NtDELLA2和擬南芥RGL2聚類在一起；NtDELLA3和擬南芥RGA聚類在一起（圖6）。

圖6 不同物種DELLA蛋白的進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of DELLA proteins of different species

三維結構建模結果如圖7所示，在3個DELLA蛋白的三維結構中有保守的N端DELLA結構域和C端的GRAS結構域，兩者由中間的部分肽段相連。且蛋白兩端結構非常保守，而連接DELLA和GRAS結構域的中間部分氨基酸序列變化較大。此外，煙草中的3個DELLA蛋白與擬南芥的DELLA蛋白GAI空間結構高度相似，所以可能也有相似的功能——作為赤霉素信號通路中的抑制因子發揮作用。

圖7 煙草NtDELLAs蛋白三維結構預測Fig.7 Predicted tertiary structures of NtDELLAs

通過Plant-mPLoc植物蛋白質亞細胞定位在線預測工具對本研究中的煙草DELLA蛋白家族成員DELLA1～DELLA4進行亞細胞定位預測，發現DELLA1～DELLA4定位在細胞核中，這與其他作物中DELLA蛋白的亞細胞定位結果一致，說明煙草DELLA蛋白也定位于細胞核中，并在細胞核中發揮其轉錄抑制功能。

2.3 不同生長發育時期NtDELLAs表達特異性分析

煙草不同生長發育時期煙草DELLA基因家族的表達量如圖8所示。由表達曲線可見NtDELLA1基因整體表達量較高，各個時期NtDELLA2和NtDELLA3表達量相近且趨勢相同。從小十字期到團顆期NtDELLA1表達水平有一個緩慢的上升趨勢，在團棵期的表達量達到最高，旺長期表達量明顯下調，在盛花期表達量最低，且NtDELLA1在不同時期的表達量均高于NtDELLA2和NtDELLA3，這也表明NtDELLA1可能是煙草DELLA家族成員的主效基因；NtDELLA2在不同的生長發育時期表達波動較小，但從營養生長到生殖生長時期表達量有逐漸降低的趨勢，但在成熟期略有回升；NtDELLA3基因在煙苗營養生長階段表達量逐漸上升，旺長期達到最高，但旺長期到盛花期NtDELLA3的表達量急劇下調，在盛花期達到最低，在衰老過程中表達量又有所回升。由此可見，NtDELLA3可能參與調控煙草開花及衰老。

圖8 不同生長發育時期煙草NtDELLAs表達量Fig.8 Relative expression levels of NtDELLAs at various growth and development stages

2.4 逆境條件及激素處理對煙草DELLA基因家族表達的影響

3個煙草DELLA基因對不同的外界因素刺激表現出不同的響應模式。如圖9所示，煙草DELLA基因家族3個基因對低溫、干旱和TMV接種響應較為強烈，而鹽脅迫對DELLA基因家族的表達影響不大。在低溫脅迫的條件下，NtDELLA1基因的表達顯著上調，而NtDELLA2和NtDELLA3基因的表達則沒有顯著差異；在干旱脅迫條件下，DELLA基因家族3個基因的表達均明顯下調，其中NtDELLA1和NtDELLA2的下調尤其明顯。此外，TMV接種導致煙草DELLA基因家族的3個基因上調表達，說明煙草DELLA基因家族的表達能夠被TMV接種顯著誘導。

圖9 NtDELLAs對多種逆境的響應Fig.9 Responses of NtDELLAs to various stress

施加外源GA和ABA的煙草DELLA基因家族的表達模式見圖10。在施加外源GA時，煙草的3個NtDELLA基因在第0～14 h區間整體顯示出了下降趨勢，NtDELLA1在處理后第11 h降至最低值，之后逐漸回升；但NtDELLA2在處理后第5～8 h區間內顯著下降，之后緩慢下降，在處理后第14 h達到最低水平。施加外源ABA后DELLA家族成員的表達結果顯示，在ABA施加后的第11～14 h，DELLA蛋白的轉錄水平被抑制最為顯著，NtDELLA1和NtDELLA3在處理后第0～14 h整體呈下降趨勢，但NtDELLA1在處理后第5～8 h間有顯著下降，之后緩慢下降，在處理后第14 h達到最低值；NtDELLA2在處理后第11 h達到最低水平，之后出現回升趨勢。

圖10 NtDELLAs對GA和ABA的響應Fig.10 Responses of NtDELLAs to GA and ABA

3 討論

本研究中發現NtDELLAs對低溫、干旱和TMV侵染3種脅迫的響應較明顯，對鹽脅迫不敏感，其中NtDELLA1對低溫脅迫響應最為明顯，所有NtDELLAs對干旱脅迫均表現出明顯的下調模式，這與前人的研究結果一致［20-21］，說明GA信號通路和ABA信號通路存在交聯，干旱脅迫條件下NtDELLA基因的下調可能和ABA應答干旱脅迫相關。NtDELLA2在TMV接種后表現出明顯的上調，說明煙草DELL A基因家族參與煙草對TMV的應答過程。

GA處理導致DELLA基因家族成員表達下調，說明外源GA不僅誘導內源DELLA蛋白降解，同時施加外源ABA也出現了和GA處理類似的結果，尤其是在ABA施加后的第11～14 h時DELLA基因的轉錄水平受抑制的程度最大，這和前人的研究結果一致［22］，說明GA也可通過某種調節方式，在轉錄水平上抑制DELLA基因的轉錄，其機制有待進一步研究。DELLA基因轉錄水平的變化又會導致其蛋白水平的變化，DELLA蛋白精細調控植物的生長發育與抗逆性以適應環境因子變化的相關分子機制也仍待進一步研究。同時，隨著基因編輯技術的發展，可通過基因編輯技術改變煙草DELLA基因的序列，從而創制出在煙草株型、生物量和抗逆性等方面具有獨特表型的煙草株系，為煙草育種提供重要的種質資源。

4 結論

煙草中克隆的4個NtDELLA基因，除NtDELLA4基因結構N端出現缺失為假基因外，NtDELLA1、NtDELLA2和NtDELLA3編碼的蛋白均具有典型的DELLA蛋白結構。NtDELLAs在煙草不同組織及不同生長發育時期均有表達，其中NtDELLA1表達量最高，說明NtDELLAs基因家族成員間功能存在冗余，NtDELLA1可能為煙草DELLA基因家族的主效基因。此外，煙草NtDELLAs在低溫脅迫、干旱脅迫、鹽脅迫和TMV接種4種逆境條件下均有轉錄水平的響應，響應模式各異。NtDELLAs對GA和ABA的響應模式類似，均表現出轉錄水平的抑制。