利用高密度Bin 圖譜定位水稻葉綠素含量QTL

潘俊峰，崔克輝，劉彥卓，王昕鈺,，嚴博宇,，梁開明

（1.廣東省農業科學院水稻研究所/ 廣東省水稻育種新技術重點實驗室/ 廣東省水稻工程實驗室/農業農村部華南優質稻遺傳育種重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.華中農業大學植物科技學院/作物遺傳改良國家重點實驗室/農業農村部長江中游作物生理生態與耕作重點實驗室，湖北 武漢 430070）

【研究意義】水稻是我國主要糧食作物，其高產與穩產對我國糧食安全意義重大。氮是植物需求量最大的養分之一。在水稻生長發育過程中，合理施用氮肥可增加產量，氮營養供應不充足則會導致水稻減產［1］，而過量施用氮肥會導致環境污染等問題［2-3］。水稻葉綠素含量是對氮肥施用最為敏感的表型性狀之一，與植株光合作用密切相關；研究水稻葉綠素含量的遺傳機制，對氮高效的高產水稻品種選育具有重要意義［4-6］。【前人研究進展】水稻葉片葉綠素屬于多基因調控的數量性狀，其合成與降解易受環境影響［7］。利用不同遺傳群體分析苗期、抽穗期和灌漿期等時期不同部位葉片的水稻葉綠素含量，已成功定位了超過600 個QTL，分布于12 條染色體上［7-10］。QTL 定位最終目的是用于基因鑒定和育種應用，以往研究大多采用RFLP、SSR 和STS 標記構建遺傳連鎖圖譜，鑒定的主效QTL 檢出率偏低且鑒定位點數量也較少［9］。隨著基因組測序技術的快速發展與應用，構建Bin 圖譜用于QTL 檢測、候選基因篩選和分子標記開發逐步受到關注［9,11-12］。已有研究在同一試驗點經2 年重復試驗，利用Bin 圖譜檢測到2 個控制葉綠素含量的QTL，并篩選到9 個候選基因［9］。前人也在不同氮處理下定位到14 個控制葉寬的SNP 位點，并鑒定出20個與高氮和低氮響應有關的SNP 位點，同時研究者建議，對易受環境影響的性狀開展高密度Bin圖譜定位分析時，結合多處理、多年、異地環境的分析更能提高QTL 定位的精準度［13］。利用高密度Bin 圖譜開展QTL 定位，精確度高，是深入研究重要復雜生理性狀遺傳規律的有效方法［9］。【本研究切入點】葉綠素含量是容易受環境因素影響的數量性狀［14］，尤其易受氮肥施用量的影響。然而經多年份、多時期開展不同氮肥施用量條件下的有關葉綠素含量精細QTL 定位的研究仍鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究采用不同年份、地點的珍汕97 和明恢63 水稻重組自交系群體為材料，測定不施氮和正常施氮條件下水稻葉片葉綠素含量，開展不同發育時期葉片葉綠素含量高密度Bin 圖譜QTL 定位分析，旨在尋找一些新的、穩定的葉綠素含量相關位點，以期為水稻葉綠素含量相關基因的鑒定和高光效水稻分子標記育種改良提供有利靶標。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻材料為珍汕97（ZS97）和明恢63（MH63）重組自交系（RIL），由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室水稻研究團隊提供。該群體共210 個家系，從F11中隨機選取113個家系用于本研究。

RIL 高密度圖譜包括1 619 個重組Bin 標記，各染色體Bin 標記數為79～217 個，總長1 625.5 cM，平均約1.0 cM/bin，標記間平均物理距離約為230 kb［11］。本研究采用的Bin 標記詳細數據和圖譜均由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室水稻研究團隊提供。

1.2 大田試驗

本試驗分別于2006 年5—10 月在湖北省孝感市新鋪鎮（30°56'' N、113°54'' E）、2007 年5—10 月在湖北省武穴市大金鎮（29°51'' N、115°33'' E）進行。兩地稻田表層25 cm 土壤主要養分分別為：新鋪鎮pH 值（1 ∶1 土水比）5.01，有機質含量30.06 g/kg，全氮含量1.39 g/kg（2006年）；大金鎮pH 值（1 ∶1 土水比）5.37，有機質含量22.76 g/kg，全氮含量1.09 g/kg（2007 年）。

采用秧盤育秧，種植密度16.7 cm×20.0 cm，劃行移栽，每個家系種植1 個小區，小區面積4.8 m2（2.0 m×2.4 m）。小區采用隨機區組排列，設置正常氮水平（2006：130 kg/hm2；2007：135 kg/hm2）和低氮水平（0 kg/hm2）處理，每個處理3 次重復，肥料運籌參照文獻［15］。精細管理并全程防治病蟲害，成熟期掛防鳥網避免產量損失。兩年的試驗設計與管理措施保持一致。

1.3 葉綠素含量測定

分別于移栽后30 d（30 Days after transplanting，30 DAT）和抽穗期（Heading，HD），采用502型SPAD（Soil and Plant Analyzer Development）葉綠素儀進行水稻葉片葉綠素含量測定。移栽后30 d，測定各小區除邊行外植株的主莖1.5 葉，分別測定葉片的中部和中部上、下3.0 cm 處，取3 處平均值表示該葉片SPAD 值，每小區重復測定10片葉。由于RIL 群體家系的抽穗期相差較大，各小區抽穗10%定義為抽穗期。抽穗期直接測定植株主莖劍葉的SPAD 值，其他操作與移栽后30 d的檢測方法相同。

采用Statistix 9.0 軟件進行數據分析，差異顯著性檢驗用獨立樣本t 檢驗和單因子方差分析（one-way ANOVA，LSD）。

1.4 QTL 定位

利用QTL IciMapping V3.4 軟件，采用完備區間作圖法（Inclusive Composite Interval Mapping，ICIM）在全基因組范圍內進行掃描［16］，掃描步長為1.0 cM，分別檢測不同處理和不同發育時期控制葉綠素含量的QTL。以LOD ≥2.5 作為閾值檢測QTL，計算每個QTL 的貢獻率和加性效應。QTL 的命名方法參照McCouch 等［17］公布的規則。

2 結果與分析

2.1 不同氮處理下RIL 群體和親本不同發育時期的葉綠素表型變異

由表1 可知，2006、2007 年RIL 群體和親本均表現為低氮條件下的葉片葉綠素含量顯著低于正常氮處理。親本葉片葉綠素含量兩年均表現為母本珍汕97 高于父本明恢63；在移栽后30 d，同一親本相同處理的不同年份差異不大；在抽穗期，2007 年明恢63 的葉片葉綠素含量顯著高于2006 年。RIL 群體中的葉綠素含量分布均表現為連續的正態分布，并且有超親分離現象，呈現數量性狀的特點（圖1）。

表1 不同氮處理RIL 群體及其親本的葉綠素含量分析Table 1 Analysis of chlorophyll contents in RIL population and its parents under different nitrogen treatments

2.2 不同年份和不同發育時期水稻葉片葉綠素含量相關性分析

移栽后30 d、抽穗期的水稻葉片葉綠素含量相關系數分別達到極顯著水平（表2）。此外，葉綠素含量在不同氮處理、不同發育時期均表現出顯著相關性，兩年表現一致，表明兩年葉綠素含量的環境穩定性較好。

表2 不同氮處理水稻葉片葉綠素含量的相關系數Table 2 Correlation coefficients of chlorophyll contents in leaves of rice under different nitrogen treatments

2.3 水稻葉片葉綠素含量的QTL 檢測

低氮處理下葉片葉綠素含量，兩年共檢測到5 個QTL（2006 年1 個、2007 年4 個），分別位于第3、6、10 號染色體；正常氮處理下葉片葉綠素含量，兩年共檢測到10 個QTL（2006 年4 個、2007 年11 個），分別位于第1、2、3、6、7、10、11 號染色體（表3），正常氮處理下檢測到的QTL 明顯多于低氮處理。在第4、5、8、9 號染色體上沒有檢測到控制葉綠素含量的QTL。15個QTL 在染色體上的分布如圖2 所示。

表3 不同氮處理下水稻葉片葉綠素含量的QTL 檢測結果Table 3 QTL detection for chlorophyll contents in leaves of rice under different nitrogen treatments

第1、2、11 號染色體上分別檢測到1 個QTL。其中，q30CHL1位于第1 染色體，在2006年低氮處理水稻葉片中被檢測到，影響移栽后30 d 的葉綠素含量，解釋14.57%的表型變異，增效基因來自珍汕97；qHDCHL2位于第2 號染色體，在2007 年正常氮處理水稻葉片中被檢測到，等位基因來自明恢63，解釋8.50%的表型變異；qHDCHL11位于第11 號染色體，在2007 年正常氮處理水稻葉片中被檢測到，對表型的貢獻率為7.41%。

第3 染色體上共檢測到4 個QTL，均于2007年的水稻葉片中被檢測到，等位基因均來自明恢63；在低氮處理葉片中檢測到2 個QTL，q30CHL3-1影響移栽后30 d 的葉綠素含量，解釋11.75%的表型變異，qHDCHL3-1影響抽穗期的葉綠素含量，解釋1.21%的表型變異。另外兩個QTL（q30CHL3-2和qHDCHL3-2）在正常氮處理水稻葉片中被檢測到，分別解釋11.38%和11.46%的表型變異。

第6 染色體上共檢測到 4 個 QTL，均影響抽穗期劍葉的葉綠素含量，且等位基因均來自珍汕97；在2006 年的水稻葉片中檢測到2 個QTL，低氮和正常氮處理下各1個，均位于染色體8.45～9.12 Mb 處，命名為qHDCHL6-1，低氮和正常氮處理檢測到的QTL 分別解釋28.01%和19.46%的表型變異；在2007 年的水稻葉片中也檢測到2個QTL，qHDCHL6-1在低氮水平下同樣被檢測到，解釋1.55%的表型變異，qHDCHL6-2在正常氮水平下檢測到，解釋9.35%的表型變異。qHDCHL6-1在2 年低氮處理下和2006 年正常氮水平下均被檢測到，表現出較強的穩定性。

第7 染色體上共檢測到2 個QTL，均為正常氮水平下影響抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL，且等位基因均來自珍汕97；qHDCHL7-1于2006 年的水稻葉片中被檢測到，可解釋8.42%的表型變異；qHDCH7-2于2007 年的水稻葉片中被檢測到，可解釋8.74%的表型變異。

第10 染色體上共檢測到2 個QTL，均于2007 年的水稻葉片中被檢測到，增效等位基因均來自珍汕97；qHDCHL10-1在低氮處理下被檢測到，是所有QTL 中效應最大的位點，解釋40.74%的表型變異；qHDCHL10-2在正常氮處理下被檢測到，可解釋7.53%的表型變異。

2.4 主效QTL 區段中候選基因的篩選

利用水稻基因組注釋數據庫（http://rice.uga.edu/）對重復檢測到的qHDCHL6-1區間內的基因進行功能注釋。qHDCHL6-1位于第6 號染色體的8.45～9.12 Mb 處，經查詢，該區間內共有113 個注釋基因，除去不轉錄蛋白、逆轉錄轉座子蛋白、修復蛋白、假定蛋白等相關基因89 個，共篩選到4 個有關葉綠素代謝和影響水稻葉色的候選基因（表4）。

表4 qHDCHL6-1 區間內的基因預測Table 4 Predicted genes in interval of qHDCHL6-1生物與非生物脅迫響應等方面發揮重要調控作用［18］。

LOC_Os06g15370已被克隆，為硝酸鹽轉運子/肽轉運蛋白基因OsNPF3.1，該基因通過調控水稻株高、抽穗期和千粒重，影響水稻氮肥利用效率。LOC_Os06g15420已被克隆，為天冬酰胺合成酶基因OsAS2。LOC_Os06g15590注釋為類似細胞數目調節蛋白，影響細胞增殖和生長，負向調控器官的形態發育。LOC_Os06g15620注釋為受赤霉素誘導的基因家族蛋白（GAST），GAST 家族在植物激素信號轉導、葉片發育及

3 討論

3.1 本研究定位的QTL 中已鑒定的功能基因

前人利用不同的定位群體和標記類型檢測到大量控制不同時期、不同處理以及不同部位葉片葉綠素含量的QTL，但這些位點對表型的貢獻率均較低、主效基因較少，表明水稻葉片葉綠素含量的遺傳背景較為復雜［7-8］。本研究采用高密度Bin 連鎖圖譜，從兩年的水稻葉片中共檢測到15個控制移栽后30 d 和抽穗期葉片葉綠素含量的QTL，其中7 個對表型的貢獻率超過10%，表明設置不同氮肥處理更有利于揭示葉綠素含量的遺傳規律。

本研究檢測到的QTL 與前人定位或克隆的QTL 有交叉重疊（表5）。例如，q30CHL1位于第1 染色體33.84～34.74 Mb 處，在該區域已經克隆S-磺基半胱氨酸合酶基因（GRA78），該基因主要功能是直接調控葉綠體內基粒和類囊體的生長發育，在水稻苗期和分蘗期分別調控Chla、Chlb 和總葉綠素含量性狀，突變體的葉綠素含量在苗期和分蘗期分別比野生型降低63.6%和32.5%［19］。前人在qHDCHL2區域發現了1 個光系統I（PSI）色素結合膜蛋白（Lhca），該蛋白與PSI 結合形成的復合體對太陽能具有極高的轉化效率［20］。qHDCHL6-1位于第6 染色體8.45～9.12 Mb 處，前人利用F2群體在該區段定位到一個與氮肥利用效率密且相關的qNUE6位點，利用近等基因系進行生理分析發現，該位點存在2 個與擬南芥AtNPF3.1和ASN2高度同源的基因［21］。qHDCH7-2位于第7 染色體7.26～8.41 Mb 處，該區域已經克隆了亮氨酸羧基甲基轉移酶基因（OsMTS1），該基因突變會導致水稻葉傾角增大、葉片葉綠素含量降低40%、葉片早衰和產量顯著降低［22］，過表達則能夠提高水稻產量15.69%［23］。qHDCHL10-1對表型的貢獻率為40.74%，前人在該區段鑒定到2 個Chla 加氧酶基因OsCAO1和OsCAO2，它們在染色體上是串聯的，Chla 加氧酶承擔催化Chla 合成Chlb 的功能，OsCAO1在有光條件下起主要作用，而OsCAO2主要在黑暗或無光照條件下發揮作用［24］。本研究中，qHDCHL10-1僅在低氮條件下檢測到，該基因是否受到低氮處理的強烈誘導目前仍不清楚。qHDCHL10-2在正常氮處理下檢測到，前人用秈粳交群體在該區域定位到拔節期和抽穗期葉綠素含量穩定表達的qCJ10和qCH10。前人利用粳粳交RIL 在第11 號染色體定位到成熟期劍葉葉綠素含量相關的QTL，與qHDCHL11有重疊片段［25］。

表5 本研究定位的QTL 和已知葉綠素含量相關位點/基因的位置比較Table 5 Comparison of known QTL/genes contributed to chlorophyll content with QTL detected in this study

3.2 qHDCHL6-1 是控制葉綠素含量的主效QTL

本研究結果顯示，在正常氮處理水稻葉片中檢測到的QTL 數量明顯多于低氮處理，表明低氮處理限制了部分QTL 的表達。前人研究建議，對氮肥敏感的數量性狀應加強在多環境下的分析［13］。qHDCHL6-1在2006 年抽穗期的兩個氮處理中均被檢測到，在2006 年的正常氮處理中也被檢測到，表明該位點屬于控制抽穗期葉綠素含量的穩定表達的QTL。通過水稻基因組注釋數據庫比對發現，該區間中存在4 個候選基因，其中LOC_Os06g15370和LOC_Os06g15420兩個基因已克隆，分別為硝酸鹽轉運子/肽轉運蛋白基因OsNPF3.1和天冬酰胺合成酶基因OsAS2，兩個基因均對氮素吸收利用具有重要作用［26-27］；低氮處理會刺激OsAS2和OsNPF3.1表達，增加水稻對氮素的吸收利用［26,28］，本研究結果也驗證了這一點。LOC_Os06g15620是GAST 家族基因，該基因已在2009 年克隆，被命名為OsGSR1，是GA 信號的正調節因子，在油菜素內酯（BR）和GA 信號通路中起重要作用，并介導兩者互作，在器官形態建成中正向調控細胞分裂，此外還密切參與植物組織抵抗生物脅迫和氧化還原反應［18,29］，但LOC_Os06g15620對葉片葉綠素含量的調控機理目前仍不清楚。LOC_Os06g15590為類似細胞數目調節蛋白基因，該基因仍未被克隆，但在第2 染色體上的同源基因OsCNR1（LOC_Os02g52550）已被克隆，其負調控器官細胞的數量和大小［30］，該基因是否調控葉綠體大小或葉片厚度，目前仍不清楚。因此，推測qHDCHL6-1作為控制葉綠素含量的主效QTL，OsGSR1和LOC_Os06g15590有可能參與調控葉片細胞的分化、排布和器官形態建成。綜上所述，qHDCHL6-1是多方面調控水稻葉片葉綠素含量的熱點區間，具有深入挖掘的潛力，同時對高光效、氮高效水稻品種改良也具有重要應用價值。

4 結論

本研究以珍汕97×明恢63 重組自交系（F11）113 個家系為QTL 分析的試驗材料，在大田栽培條件下，設置低氮和正常氮兩種氮肥處理，分別在兩年和兩個發育時期測定葉片葉綠素含量，利用高密度Bin 遺傳圖譜和完備區間作圖法共檢測到15 個控制葉片葉綠素含量的QTL。其中，低氮處理共檢測到5 個QTL，正常氮處理共檢測到10個QTL。發現1 個低氮和正常氮水平下穩定表達的QTLqHDCHL6-1，等位基因來自珍汕97，控制抽穗期劍葉葉綠素含量，在該區段篩選到4 個候選基因。