基于CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的水稻定向改良研究進展

李文龍，欒鑫，張強，余寧，馮曉敏，劉志霞

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/ 廣東省水稻育種新技術(shù)重點實驗室/ 廣東省水稻工程實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南優(yōu)質(zhì)稻遺傳育種重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

水稻是功能基因組學(xué)研究的模式作物，同時也作為世界上重要的糧食作物養(yǎng)育了全球超過半數(shù)的人口［1］。我國是目前世界上最大的稻米生產(chǎn)國和消費國，約60%的人口以稻米為主食［2］。水稻生產(chǎn)是關(guān)系糧食安全、人民生活福祉和國家長治久安的頭等大事。中國稻作文化源遠流長，是水稻種植歷史最為悠久的國家，也是水稻種質(zhì)資源富國和稻作科技強國［2］，先后引領(lǐng)了以“矮化育種”和“雜種優(yōu)勢利用”為基礎(chǔ)的兩次水稻“綠色革命”［3］。經(jīng)過一代又一代稻作科學(xué)家的接續(xù)努力，水稻育種技術(shù)發(fā)展迅速，先后經(jīng)歷了純系育種、雜交育種、誘變育種和分子育種等各個階段，水稻產(chǎn)量記錄不斷刷新［2］。目前，我國水稻育種已經(jīng)進入以秈粳亞種間雜種優(yōu)勢利用為基礎(chǔ)的“5G 時代”［4-5］，將繼續(xù)引領(lǐng)世界稻作發(fā)展。

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人民生活水平不斷提高，對稻米的需求逐步從“吃得飽”到“吃得好”轉(zhuǎn)變，對水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性提出了更高的要求，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗新品種的培育已經(jīng)成為水稻育種追求的主要目標。稻米需求的升級為水稻育種技術(shù)帶來了新的要求和挑戰(zhàn)，以往的遺傳改良方法如雜交育種、回交育種、誘變育種、分子標記輔助選擇育種和轉(zhuǎn)基因育種等，有的具有明顯缺點或局限，有的面臨一些實際技術(shù)問題無法大范圍推廣使用，已不利于水稻品種的快速迭代升級改良：雜交育種、回交育種具有后代分離大、難以快速穩(wěn)定、育種周期較長、盲目性大等缺點；誘變育種具有變異方向不穩(wěn)定不可控、有益突變概率低、精準性不高等缺點；分子標記輔助選擇育種雖然在一定程度上解決了育種精準性的問題，但也同樣面臨連鎖累贅無法打破、耗時費力等諸多問題；轉(zhuǎn)基因育種可以通過將外源功能基因整合到受體作物的染色體上表達，達到精準定向改良作物性狀的目的，但是由于其會引入外源DNA 片段，引發(fā)對轉(zhuǎn)基因食品安全方面的擔(dān)憂而無法全面釋放應(yīng)用。相較于傳統(tǒng)育種方法，新興的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)能通過預(yù)先設(shè)定的引導(dǎo)序列，精準地對內(nèi)源目標靶基因位點進行定點突變（插入或缺失）或精準編輯（堿基替換），達到敲除或者改變目標基因功能的目的。雖然CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)依靠轉(zhuǎn)基因的方式完成，但是由于轉(zhuǎn)基因TDNA 插入位點往往與編輯位點位置不同，可以在編輯后代中通過遺傳分離得到完全沒有轉(zhuǎn)基因元件的編輯突變體。隨著CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)不斷改進和發(fā)展，編輯技術(shù)日漸穩(wěn)定成熟，目前已經(jīng)在動植物的功能基因研究、種質(zhì)資源創(chuàng)制創(chuàng)新、優(yōu)良新品種培育和定向改良中發(fā)揮重要作用。在水稻品種改良中，CRISPRCas9 系統(tǒng)能快速定向穩(wěn)定目標性狀、縮短育種周期，展現(xiàn)出強大的應(yīng)用潛力，有望成為未來水稻育種的重要輔助工具。因此，在當前形勢下，加強對水稻基因編輯技術(shù)的研究具有十分重要的現(xiàn)實意義。本文主要綜述了近年來CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)在水稻性狀定向改良上的研究進展，并對該技術(shù)的未來發(fā)展前景進行探討和展望，以期為水稻育種方法的革新與發(fā)展提供新的思路和參考。

1 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列相關(guān)系統(tǒng)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associated system，CRISPR/Cas）是細菌和古細菌體內(nèi)長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御機制，可以利用雙RNA 引導(dǎo)DNA 內(nèi)切酶在目標DNA 中引入位點特異性雙鏈斷裂來抵御外源DNA 的侵染［6］。CRISPR/Cas 是繼鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）等基因編輯技術(shù)之后的第三代基因編輯系統(tǒng)，不同于ZFN 和TALEN 系統(tǒng)的DNA 識別是依賴蛋白質(zhì)來完成，CRISPR/Cas 編輯系統(tǒng)的目標靶位點識別是利用一段短RNA 片段實現(xiàn)的。理論上Cas 蛋白可以在RNA 的引導(dǎo)下對任何一段特異的基因組DNA 序列進行精準操縱，用來闡釋基因功能、修復(fù)有害突變、抑制被激活的致病基因或者激活病癥的抑制基因；研究者可以通過一次實驗同時靶向編輯多個位點驗證多個基因的功能［6］。該技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、玉米、人類、斑馬魚、豬等動植物的基因組研究，具有設(shè)計簡單、操作簡便、成本低廉、精準高效等優(yōu)點［6-10］。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)主要分為3 種類型（圖1A），Ⅱ型主要在細菌基因組中被發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型則主要存在于古細菌，而Ⅰ型則在細菌和古細菌中均有分布［11］。3 類系統(tǒng)均含有靶向DNA 區(qū)域、crRNA區(qū)域，I 型和II 型依賴于前間區(qū)序列臨近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM），而Ⅲ型則不依賴PAM 序列［11］。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)屬于Ⅱ型系統(tǒng)，是廣泛應(yīng)用于基因編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳修飾和基因組成像等領(lǐng)域的一個強大基因編輯平臺［6］，也是目前為止研究最多最透徹、操作最簡單方便的基因編輯系統(tǒng)。在Ⅰ型、Ⅲ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，成熟的crRNA 引導(dǎo)幾個核酸酶Cas 組成的大型蛋白復(fù)合體共同發(fā)揮作用才能順利剪切外源DNA，而Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)僅需要單一的DNA 內(nèi)切酶Cas9 蛋白配合crRNA、tracrRNA 即可識別和剪切目標靶DNA，不依賴于多蛋白復(fù)合體［6,12］。為方便使用，目前常用的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)經(jīng)過簡化將crRNA 和tracrRNA 合并成一個嵌合的sgRNA 轉(zhuǎn)錄本，并完全保留了Cas9 介導(dǎo)的序列特異性剪切功能（圖1B），可以根據(jù)實驗需求設(shè)計改造sgRNA，引導(dǎo)Cas9 蛋白到基因組上特定區(qū)段，并在PAM 序列的上游剪切DNA 雙鏈形成平末端裂口［6,11,13］。當目的基因雙鏈斷裂后，裂口會被細胞中存在的DNA 修復(fù)機制所修復(fù)。修復(fù)機制可分為同源修復(fù)（HR）和非同源末端連接（NHEJ），NHEJ 修復(fù)過程中會在剪切位點產(chǎn)生小片段的插入或缺失引發(fā)基因編碼改變或者提前終止，導(dǎo)致基因沉默；HR 修復(fù)會恢復(fù)野生型序列；而在有供體 DNA 存在的情況下，斷裂位置會通過HR 修復(fù)方式進行同源修復(fù)精準地引起DNA 片段插入或替換，達到基因敲入的目的（圖1B）［6,11］。

2 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在水稻定向改良中的應(yīng)用

性狀改良是新品種不斷升級迭代的源動力。傳統(tǒng)的水稻品種改良通常采用雜交方式將各種優(yōu)異等位基因聚合于受體親本，周期漫長、費時耗力且無法打破連鎖累贅，在引入優(yōu)良基因的同時可能會帶入諸多不利基因。如何實現(xiàn)目標基因的精準快速改良，克服傳統(tǒng)育種方式的種種弊端是育種家面臨的一個亟需解決的問題。作為一種新興的基因編輯技術(shù)，由細菌免疫系統(tǒng)發(fā)展而來的CRISPR/Cas9 僅需改造引導(dǎo)RNA 序列即可實現(xiàn)基因組靶位點的定點編輯［11］。在基因編輯過程中，由于CRISPR/Cas9 基因編輯植株的轉(zhuǎn)基因標簽插入位點往往與編輯位點不在同一位置，易于在后代中獲取沒有外源基因整合的編輯材料，避免了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)致的食品安全擔(dān)憂問題。因此，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在水稻定向改良中具有巨大的應(yīng)用潛力。目前，眾多研究者已經(jīng)利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)針對水稻中的多個重要靶標展開定向改良研究工作，取得一系列研究成果（表1）。

2.1 水稻抗病性的定向改良

稻瘟病是水稻生產(chǎn)中的主要病害之一，全球每年因稻瘟病導(dǎo)致的產(chǎn)量損失約占水稻總產(chǎn)量10%～30%，稻瘟病爆發(fā)時，輕則引起水稻大幅減產(chǎn)，重則導(dǎo)致絕收［14-15］。因此，改良水稻稻瘟病抗性對水稻穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)具有重要意義。目前，水稻中已鑒定出超過100 個稻瘟病抗性位點，其中超過30 個稻瘟病抗性基因已被克隆［14,16］。在抗性基因克隆和功能解析的基礎(chǔ)上，通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)定點修飾抗性相關(guān)基因，可以有針對性地定向改良水稻稻瘟病抗性。Zhou 等［16］在秈型光溫敏不育系LK638S 背景下采用CRISPR/Cas9 技術(shù)對Bsr-d1、Pi21和ERF922等3 個已知的稻瘟病抗性相關(guān)基因進行基因編輯研究，發(fā)現(xiàn)單基因突變體和3 基因突變體的稻瘟病抗性均顯著高于野生型受體品種，同時突變體的產(chǎn)量性狀基本不受影響，為水稻抗病性的快速定向改良提供了范例。在粳稻Kuiku131 中敲除水稻稻瘟病抗性的負調(diào)控因子OsERF922也得出類似實驗結(jié)果，突變體在不影響穗數(shù)、株高、千粒質(zhì)量等重要農(nóng)藝性狀的前提下，顯著提高了稻瘟病抗性［17］。在高感稻瘟病的優(yōu)質(zhì)水稻品種大粒香中，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)定點編輯稻瘟病相關(guān)基因pid3，后代無轉(zhuǎn)基因標簽的純合突變體材料的稻瘟病抗性有效提高，因病損失率顯著降低，達到了稻瘟病抗性定向改良的目標［15］。編碼區(qū)內(nèi)21 bp 和48 bp 的兩處缺失導(dǎo)致pi21功能喪失，進而賦予水稻稻瘟病廣譜抗性，房耀宇等［18］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在Pi21基因的外顯子區(qū)域設(shè)計2 個靶標位點對該基因進行敲除研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在敲除Pi21的突變體中該基因發(fā)生移碼突變，表達量較野生型品種明顯降低，稻瘟病抗性則顯著提高。OsVQ25 通過與E3 泛素連接酶OsPUB73和轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY53 互作，在平衡水稻的廣譜抗病性和生長發(fā)育中發(fā)揮重要功能［19］。VQ25通過抑制OsWRKY53的功能負向調(diào)控水稻抗病性，在水稻中敲除VQ25，敲除突變體的稻瘟病抗性得到顯著提高，而其他農(nóng)藝性狀基本不受影響，表明CRISPR/Cas9 技術(shù)改良作物性狀可以做到精準定向、有效避免連鎖累贅。

白葉枯病是一種由水稻黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzaepv.Oryzae，Xoo）引起的毀滅性水稻病害，白葉枯病頻繁爆發(fā)嚴重威脅水稻生產(chǎn)。水稻OsSWEET14基因是已知大部分Xoo菌株的易感靶標，能夠被Xoo中的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子（TAL）通過結(jié)合其啟動子區(qū)域的效應(yīng)子結(jié)合元件（EBE）激活表達，從而負向調(diào)控水稻的白葉枯抗性，不同研究者分別利用CRISPR/Cas9 技術(shù)定點編輯OsSWEET14的基因編碼區(qū)和啟動子序列的EBE 元件，均獲得白葉枯病抗性顯著提高的水稻材料［20-21］，并且可保持主要農(nóng)藝性狀基本不改變［20］。為改良IR24 的白葉枯病抗性，郝巍等［22］利用CRISPR/Cas9 定點編輯了與白葉枯病抗性相關(guān)的Pong2-1、Pong11-1兩個基因位點，發(fā)現(xiàn)與野生型IR24 相比，突變體pong2-1和pong11-1的主要農(nóng)藝性狀無顯著變化，但對白葉枯病的抗性顯著提高，由此創(chuàng)制出新的白葉枯病抗性材料。Xig1（Xoo-induced gene 1）是一個受水稻白葉枯病菌誘導(dǎo)表達的基因，與感白葉枯病相關(guān)。在秈稻IR24 背景下敲除Xig1的突變體對白葉枯病菌敏感性降低，接種14 d 后突變體的病斑長度較野生型降低53%～65%，白葉枯病抗性提高且突變株系在主要農(nóng)藝性狀上與野生型IR24 無顯著差異［23］。武廣珩等［24］通過CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除水稻的免疫防衛(wèi)相關(guān)基因OsEDR1，白葉枯病原菌XooPXO99 的接種侵染試驗結(jié)果顯示，突變體水稻植株病斑長度相較于野生型日本晴減少約50%，白葉枯病抗性明顯增強。除修飾單個基因位點獲得某一特定抗性外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯1 個抗性基因也可以實現(xiàn)多種抗病性狀協(xié)同改良的目標。研究發(fā)現(xiàn)，Pi21或ERF922的單基因敲除突變體除可顯著提高水稻稻瘟病抗性外，白葉枯病的抗性也得到顯著增強［16］；在水稻中敲除OsVQ25能同時協(xié)同提升稻瘟病和白葉枯病的抗性［19］。

稻瘟病和白葉枯病是水稻生產(chǎn)中面臨的主要病害，爆發(fā)嚴重時會造成水稻大幅減產(chǎn)甚至絕收［14,20-21］。長期通過噴灑農(nóng)藥防控水稻病害，會造成環(huán)境污染、藥害、推高水稻生產(chǎn)成本等一系列問題，因此，通過培育抗病新品種來改良水稻的抗病性，是解決水稻病害問題最直接、最有效、最經(jīng)濟的方法。通過雜交育種方法改良水稻抗病性周期過長，加上病菌進化變異速度快，往往經(jīng)過多年雜交、回交導(dǎo)入的抗性基因剛剛穩(wěn)定就已失去對新的病菌小種的抗性作用，嚴重制約抗病新品種的培育。前人研究表明，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)定向改良抗病相關(guān)基因，如pid3［15］、Bsr-d1［16］、ERF922［16-17］、Pi21［16,18］、VQ25［19］、OsSWEET14［20-21］、Pong2-1［22］、Pong11-1［22］、Xig1［23］、OsEDR1［24］等，能在基本不改變其他主要農(nóng)藝性狀的前提下，在短期內(nèi)（兩個水稻生長世代）獲得純合穩(wěn)定、不含轉(zhuǎn)基因標簽的定向改良水稻新材料。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)大大提高了育種效率、縮短了育種年限，為未來水稻抗病性的定向改良提供了參考和范例。

2.2 水稻品質(zhì)的定向改良

稻米品質(zhì)是復(fù)雜的農(nóng)藝性狀，包括外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等，是水稻商品價值的重要衡量因素。香氣被認為是優(yōu)質(zhì)稻米的重要指標，水稻OsBadh2基因功能的缺失導(dǎo)致2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的積累是水稻香氣形成的主要原因。研究者在不同的遺傳背景下運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對OsBadh2進行敲除研究，發(fā)現(xiàn)敲除突變體材料的2-AP 含量均能顯著提高，可以產(chǎn)生強烈香氣，稻米食味性狀得到快速精準改良［18,25-26］。直鏈淀粉含量是影響水稻口感的重要因素，黃李春等［27］在粳稻日本晴背景下，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在Wx 基因編碼區(qū)的C 端第12、13 外顯子處設(shè)計2 個靶標位點進行定點敲除研究，獲得8 種無轉(zhuǎn)基因標簽的純合突變材料。與野生型相比，8 種突變材料的農(nóng)藝性狀無顯著變化，但是直鏈淀粉含量從16.79%下降至3.69%～4.44%，得到直鏈淀粉含量極低的糯稻新種質(zhì)。除編輯Wx 基因的編碼區(qū)，研究者還利用CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯Wx 基因啟動子上的關(guān)鍵順式作用元件，通過調(diào)節(jié)Wx 基因的表達量，進而達到改良稻米直鏈淀粉含量的目的［28-30］。毛興學(xué)等［28］在秈稻保持系吉豐B 背景下，定向編輯Wx 基因的編碼區(qū)上游序列，得到兩份低直鏈淀粉含量的水稻新種質(zhì)。Huang 等［29］通過分析Wx基因啟動子序列上的順式作用元件，并選擇7 個靶標作為編輯位點，通過下調(diào)Wx 基因的表達量調(diào)節(jié)稻米直鏈淀粉含量，獲得6 個新的Wx 等位基因類型。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯Wx 基因的啟動子序列，Zeng 等［30］也在高直鏈淀粉含量的保持系天豐B 背景下獲得了直鏈淀粉含量不同程度降低的一系列新材料。Sun 等［31］運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對水稻淀粉分支酶基因SBEI、SBEIIb進行敲除研究，結(jié)果表明sbeI突變體與野生型相比無明顯差異，而sbeIIb突變體的直鏈淀粉、抗性淀粉含量分別提高至25%、9.8%，創(chuàng)制了高直鏈淀粉、高抗性淀粉含量新種質(zhì)。在外觀品質(zhì)方面，為獲得優(yōu)質(zhì)長粒水稻，徐善斌等［32］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將水稻的GS3和GS9基因位點進行編輯，高效地將圓粒形粳稻龍粳11 改造成長粒。Cheng 等［33］在粳稻日本晴背景下敲除粒形基因GS3和GL3.1，發(fā)現(xiàn)GS3敲除突變體呈現(xiàn)細長粒，同時堊白率降低；而GS3/GL3.1雙敲除突變體表現(xiàn)為大粒和高堊白，表明敲除GS3和GL3.1可以快速改良粒形并影響稻米品質(zhì)。

水稻品質(zhì)是稻米商品價值的重要影響因素，是水稻不斷升級改良的重要目標，同時也是調(diào)控最復(fù)雜的重要性狀之一。水稻品質(zhì)性狀調(diào)控涉及方面廣、參與基因多、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜。傳統(tǒng)方式對品質(zhì)性狀的遺傳改良中，往往不同性狀之間相互制約、相互影響，難以多方面協(xié)調(diào)改良。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)不僅可以精準定點修飾目標基因、有效避免不利的連鎖效應(yīng)，還能同時編輯多個基因位點，協(xié)同改良多個性狀，是復(fù)雜性狀定向改良的理想工具。此外，控制水稻重要品質(zhì)性狀的基因往往只有一個到幾個有限的等位基因類型，多樣性有限，采用傳統(tǒng)遺傳改良方法創(chuàng)制新的等位基因類型十分困難，而CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)能通過編輯基因的啟動子序列不同程度地上調(diào)或下調(diào)基因的表達量，從而產(chǎn)生一系列自然變異中不存在的新等位基因類型［28-30］，以滿足不同的需求。在未來水稻品質(zhì)定向改良、新優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)制中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 水稻育性的定向改良

在兩系法雜交水稻中，光溫敏核不育系（TGMS）是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，TMS5是調(diào)控光溫敏核不育的主效基因。梁敏敏等［34］利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在早秈品種中早70 中敲除TMS5，獲得了敗育穩(wěn)定的溫敏不育系材料。在粳稻武運粳7 號背景下敲除TMS5，同樣可以快速獲得粳型溫敏雄性不育系［35］。通過CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯TMS5基因，Zhou 等［36］僅用1 年時間即獲得具有商業(yè)應(yīng)用潛力的秈型和粳型溫敏核不育系11 個，大大提高了不育系的育種效率。水稻秈粳間雜種不育是亞種間雜種優(yōu)勢利用的主要障礙。在水稻秈粳雜種F1代，多個拷貝的Sc-i通過高表達等位抑制Sc-j導(dǎo)致花粉敗育，利用CRISPR-Cas9 敲除1～2 個Sc-i基因拷貝可以有效克服秈粳雜交F1代的雄性不育［37］，該研究為克服秈粳雜種不育、充分利用水稻亞種間雜種優(yōu)勢奠定了基礎(chǔ)。雜種優(yōu)勢的固定是一系法水稻的前提和基礎(chǔ)。Khanday 等［38］研究表明，敲除REC8、PAIR1、OSD1等3 個介導(dǎo)減數(shù)分裂的主要基因，同時異位表達BBM1 能夠調(diào)控水稻的無性繁殖而實現(xiàn)雜種優(yōu)勢固定。Wang 等［39］通過使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在雜交水稻中同時編輯REC8、PAIR1、OSD1、MTL等4 個內(nèi)源基因，在雜種一代水稻中獲得了克隆雜一代種子，有望實現(xiàn)雜種優(yōu)勢的固定，使一系法水稻的創(chuàng)制成為可能。

水稻育性是關(guān)乎產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀。在雜交水稻中，不育系是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，前人研究表明，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在不同的遺傳背景下均可以快速創(chuàng)制光溫敏核不育系［34-36］，這將大大拓寬水稻雜種優(yōu)勢的利用范圍。理論上通過利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，未來我們可以將任何一個水稻材料快速定向改造成不育系應(yīng)用于雜交水稻生產(chǎn)。秈粳雜種不育一直是水稻亞種間雜種優(yōu)勢利用的主要障礙，以往以秈粳架橋或?qū)ふ抑行杂H和基因的克服雜種不育策略，受到嚴重不育和資源的制約而困難重重，今后可以利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除秈粳亞種間雜種不育相關(guān)位點，精準快速創(chuàng)制親和性材料，將為充分利用水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢掃清障礙。

2.4 水稻耐受非生物脅迫的定向改良

除了改良上述農(nóng)藝性狀，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在水稻非生物脅迫相關(guān)性狀改良中也展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景［40］。利用 CRISPR/Cas9 定向編輯水稻ALS基因，Sun 等［41］成功獲得不含轉(zhuǎn)基因元件的抗除草劑水稻品系。Li 等［42］使用CRISPR/Cas9 編輯水稻EPSPS基因，在后代中獲得具有除草劑草甘膦抗性的水稻。這些研究為水稻耐除草劑篩選和抗除草劑育種打下基礎(chǔ)。研究者在水稻中編輯OsNAC041基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體水稻對鹽分敏感性發(fā)生變化，影響其耐鹽性［43］。在秈稻品種MTU1010 中敲除OsDST基因后，葉片增寬、氣孔密度降低、葉片保水能力提高，水稻的抗旱性和耐鹽性得到提高［44］。Chen 等［45］利用CRISPR/Cas9 敲除OsFTIP1基因，獲得更加耐旱的水稻材料。高溫是影響水稻生產(chǎn)的重要脅迫因素，Kan 等［46］研究發(fā)現(xiàn)敲除水稻TT2基因能有效提高水稻的耐熱性，同時發(fā)現(xiàn)敲除鈣敏轉(zhuǎn)錄因子SCT1和SCT2同樣可增強水稻耐熱性，為耐高溫水稻品種的定向改良提供了新思路。

隨著全球氣候變化加劇，極端天氣（如超高溫、極端低溫）頻發(fā)，加上鹽漬化土壤增多，這為未來水稻品種耐受非生物脅迫提出了更高要求。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已經(jīng)在水稻的耐鹽性［40,44］、除草劑抗性［41-42］、耐干旱［44-45］和耐高溫［46］等性狀改良中嶄露頭角，今后或?qū)⒃诟喾巧锩{迫性狀的定向改良中發(fā)揮更重要的作用。

2.5 水稻其他性狀的定向改良

抽穗期是水稻的重要農(nóng)藝性狀，抽穗期性狀的定向改良對擴展水稻品種的區(qū)域適應(yīng)性具有重要意義。Li 等［47］通過設(shè)計特異靶點在7 個主栽品種中定向編輯Hd2、Hd4、Hd5等3 個抽穗期基因，結(jié)果顯示敲除后代均能在不同程度上縮短抽穗期，達到生育期定向改良的目標。抗倒伏是保證水稻穩(wěn)產(chǎn)的重要性狀，在水稻中敲除OsRhoGDI2基因可以縮短水稻第Ⅱ、第Ⅲ莖節(jié)，顯著降低株高，提高水稻的抗倒伏能力［48］。王新等［49］運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)將水稻的SD1基因敲除，突變體中GA 水平降低，水稻株高降低，有效改良了優(yōu)質(zhì)香糯品種的抗倒性。水稻株型、穗粒數(shù)和穗型是產(chǎn)量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，研究者通過編輯IPA、Gnla、DEP1等基因，定向改良了水稻株型、穗粒數(shù)和穗型等性狀［50］。水稻開花時間是影響雜交水稻制種的主要因素，Wang 等［51］通過敲除DFOT1基因?qū)⒕局谢?1在一天中的花時提前約2.5 h，成功改良了粳稻晚花性狀，有望應(yīng)用于秈粳雜交育種中以提高秈粳雜交制種的產(chǎn)量。隨后，Xu 等［52］報道了早花基因EMF1，缺失該基因能提高漿片的吸水能力，引起早花，無論在秈稻還是粳稻中敲除該基因均能提早花時2.0～2.5 h，這為不育系花時改良提供了新途徑。為探索高油酸水稻種質(zhì)資源的創(chuàng)制，任代勝等［53］利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在粳稻日本晴中靶向敲除脂肪酸去飽和酶基因OsFAD2，敲除突變體籽粒中的油酸含量較野生型水稻提高25%～30%，為高油酸稻米育種和稻米油產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了材料基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9 作為新一代基因編輯技術(shù)，以其強大的編輯能力、極簡便的可操作性和廣闊的應(yīng)用前景，逐步成為現(xiàn)代水稻育種過程中不可或缺的重要補充，其應(yīng)用已經(jīng)深入到水稻性狀定向改良的各個方面（圖2），必將在水稻育種方式不斷革新中發(fā)揮更加重要的作用。

3 展望

目前水稻育種已經(jīng)進入新時代，對水稻品種的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等方面都提出了更高要求，以育種家經(jīng)驗為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)育種方式已逐漸不能滿足新時代的育種要求。CRISPR/Cas9 技術(shù)以其在水稻性狀定向改良中展現(xiàn)出來的無可比擬的精準性、可預(yù)見性和高效性，已然成為新時期水稻育種的重要輔助手段。此外，創(chuàng)制多樣化的種質(zhì)資源類型以滿足不同人群的消費需求也是未來水稻育種的重要方向。傳統(tǒng)遺傳方法難以在水稻中創(chuàng)制新的等位基因類型，而通過修飾基因的調(diào)控區(qū)域，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)能達到調(diào)節(jié)基因表達的目的，從而創(chuàng)制一些自然變異中不存在的新等位基因，這將在未來突破性、多樣化水稻新品種的培育中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對作物改良研究仍處于基礎(chǔ)研究或技術(shù)儲備階段，真正應(yīng)用到水稻生產(chǎn)實踐中仍面臨著不少挑戰(zhàn)和問題。首先，國際上對基因編輯作物的監(jiān)管普遍采用基于過程或基于產(chǎn)品的兩種管理方法。其中，歐盟采用基于過程的監(jiān)管方式，將基因編輯作物視作轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管；美國、加拿大和阿根廷等國家則是基于產(chǎn)品監(jiān)管，將基因編輯作物視作非轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管［54］。截至目前，我國對這種經(jīng)過轉(zhuǎn)基因過程產(chǎn)生的且不帶有轉(zhuǎn)基因元件的基因編輯產(chǎn)物，尚未按照非轉(zhuǎn)基因作物對待全面放開推廣釋放，這意味著基因編輯作物的大范圍推廣仍面臨不確定性。其次，水稻重要性狀的調(diào)控往往是涉及眾多基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中發(fā)揮重要功能的基因有些是正向調(diào)控，有些是負向調(diào)控。目前基于CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的研究絕大部分是敲除或失活基因，對增強正向調(diào)控或功能獲得性基因敲入的研究還非常少，這在很大程度上限制了CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在實際育種中的應(yīng)用。未來，根據(jù)需要對CRISPR/Cas9 基因編輯平臺與其他基因組改造技術(shù)進行深入交叉融合升級［9］，進一步擴展CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍，實現(xiàn)無轉(zhuǎn)基因元件殘存的基因增強和基因敲入功能，將大大擴寬該技術(shù)的育種應(yīng)用。再次，目前主流應(yīng)用的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，編輯靶位點設(shè)計和選擇往往需要依賴PAM序列，這將嚴重限制敲除位點的靈活選擇，難以實現(xiàn)任意位點的基因編輯，也將是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的主要限制因素。研究發(fā)現(xiàn)Ⅲ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基因編輯不需要依賴PAM 序列［11］，未來或?qū)⒕哂懈訌V闊的應(yīng)用前景。最后，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在應(yīng)用過程中會存在一定程度的脫靶現(xiàn)象，這將引起非目標區(qū)域的基因突變，導(dǎo)致編輯結(jié)果的不確定性或者偏差。以上這些因素都會影響CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在實踐中的大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)作為一種新的育種輔助手段，盡管還存在各種制約問題，但仍以其獨特的精準改造基因能力吸引著越來越多的研究者對其開展深入研究。隨著研究的不斷推進和深入，上述制約問題或?qū)⒂卸狻０袠巳我膺x擇、精準定點替換、基因敲入的實現(xiàn)將大大擴展CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在育種中的適用范圍，助推育種技術(shù)不斷革新。