達格列凈對糖尿病大鼠肺纖維化治療作用機制及效果

周蕾 房輝 張守軍 張雅中 李冰

(唐山市工人醫院 1內分泌二科，河北 唐山 063000；2急診科)

糖尿病是以葡萄糖代謝紊亂、血糖水平升高為 特征的內分泌系統疾病。長期高血糖可引起腎、眼、心臟的慢性病變。肺毛細血管豐富，血容量較大，是糖尿病的重要靶器官，研究表明糖尿病可引起肺部纖維化〔1,2〕。在慢性高血糖狀態下，細胞外基質的沉積導致肺纖維化，繼而發生阻塞性及限制性通氣功能障礙〔3〕。本研究通過建立糖尿病大鼠模型，觀察轉化生長因子(TGF)-β1/p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導通路在糖尿病大鼠肺組織表達及達格列凈的干預作用，探討達格列凈通過調控TGF-β1/p38MAPK信號傳導通路影響糖尿病肺纖維化的發生與發展。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選取8周齡左右清潔級健康SPF級SD雄性大鼠40只，體重220～260 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。所有大鼠置于通風良好，相對濕度45%～55%，溫度為18～22℃的清潔動物房內，自由飲食取水，并及時更換飼料。適應性飼養1 w后用于實驗。

1.1.2主要實驗試劑及儀器 達格列凈(阿斯利康制藥有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma公司)，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗體、兔抗大鼠纖維連接蛋白(FN)多克隆抗體(英國Abcam公司)，山羊抗鼠 IgG 二抗(R&D 公司)，二氨基聯苯胺(DAB)、免疫細胞化學法(SABC)試劑盒(美國 Pierce 公司)，β-actin(批號:CP10399，美國 Abnova 公司)，二喹啉甲酸(BCA) 試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，逆轉錄試劑盒(日本 TaKaRa 公司)，血糖儀及血糖檢測試紙條(德國羅氏公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理 將40只SD大鼠隨機分為A、B、C、D組，每組各10只，A組為對照組，B組為糖尿病組，C組為達格列凈治療4 w組，D組為達格列凈治療8 w組。除A組給予普通顆粒飼料外，其余3 組均給予高糖高脂飼料，喂養4 w后，禁食 12 h 后腹腔注射 STZ 60 mg/kg，72 h后尾靜脈采血測定空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L 為模型復制成功。A組腹腔注射等量上述枸櫞酸緩沖液。C組、D組分別給予達格列凈達1 mg/kg，每天1次喂養，治療時間分別為4、8 w，A、B組予等體積生理鹽水喂養8 w。

1.2.2標本收集與處理 末次給藥禁食12 h后，取大鼠尾末梢毛細血管全血測定FPG。殺檢前1 d空腹尾靜脈取血測定FPG、糖化血紅蛋白(HbA1c)及體重(BW)。大鼠HbA1c測定試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。大鼠于麻醉狀態下腹主動脈取血，ELISA試劑盒于30 min內進行動脈血氣分析：氧分壓(PaO2)、氧飽和度(SaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)。用電子天平稱量并記重量。留取各組大鼠肺組織標記后放置-80℃保存。

1.2.3免疫組織化學(SP)染色 按照SP試劑盒說明書檢測各組TGF-β1、p38MAPK、FN蛋白表達情況。用病理圖像分析系統 Image-Pro Plus6.0 進行免疫組化圖像分析,陽性表達是呈棕黃色顆粒。

1.2.4Western印跡 取出保存的肺臟組織，加入蛋白裂解液裂解肺組織，提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取出20 μg 統一上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，凝膠移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜行轉膜反應后加入封閉液，清洗之后添加一抗，4℃過夜孵育，添加二抗，隨后電化學發光(ECL)顯色，置于凝膠成像儀中觀察TGF-β1、p38MAPK 、FN蛋白表達情況。

1.2.5RT-聚合酶鏈反應(PCR)檢測NF-κB mRNA的表達 取新鮮冰凍組織約100 mg，按照Trizol一步法提取RNA,取等量RNA按逆轉錄試劑盒進行逆轉錄得到cDNA，取擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳上進行電泳。以β-actin光密度值進行標準校正計算PCR產物相對含量。PCR 引物 用 Primer3在線引物設計軟件設計，PCR引物由上海生物工程有限公司合成，β-catenin正義鏈：5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3′,反義鏈：5′-CACCAGAC-AGCACTGTGTTG-3′;核轉錄因子(NF)-κB：正義鏈：5′-TGTGGTGGAGGACTTGCTGAGG-3′,反義鏈：5′-AGTGCTGCCTTGCTGTTCTTGAG-3′。退火溫度分別為58℃、61℃。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組FPG、HbA1c、BW、PaO2、SaO2、PaCO2水平比較 與A組比較，B組FPG、HbA1c、PaCO2水平均顯著升高，BW、PaO2、SaO2水平均顯著降低(均P<0.05)；與B組比較，C組和D組FPG、HbA1c、PaCO2水平均顯著降低，BW、PaO2、SaO2水平均顯著升高(均P<0.05)。C組和D組上述指標水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2肺組織病理學變化 與A組比較，B組肺組織結構紊亂，膠原纖維組織增生、變厚，肺泡間質及毛細血管基底膜變厚，部分肺泡腔塌陷及萎縮。與B組比較，C組和D組肺組織結構紊亂程度較前好轉，肺泡間質及毛細血管基底膜較前變薄，肺泡腔萎縮甚至塌陷程度較前有所恢復。且D組較C組更明顯。見圖1。

2.3各組TGF-β1 p38MAPK、FN水平比較 免疫組化示B組肺組織中，TGF-β1、p38MAPK、FN呈間斷不連續分布表達于肺間質及血管上皮細胞核周圍的胞質，著色較A組明顯加深，呈強陽性表達(P<0.01)。與B組比較，C組及D組著色相對較淺，且D組更為明顯。見圖2。免疫組化及Western印跡結果顯示：與A組比較，B組TGF-β1、p38MAPK、FN水平均顯著升高(均P<0.05)；與B組比較，C組和D組TGF-β1、p38MAPK、FN水平均顯著降低，且D組更顯著(均P<0.05)。見表2、表3、圖3。

表2 免疫組化檢測各組TGF-β1、p38MAPK 、FN的表達

表3 Western印跡檢測各組TGF-β1、p38MAPK、FN的表達

2.4各組肺組織中NF-κB mRNA比較 與A組(0.68±0.04)比較，B組NF-κB mRNA水平(2.12±0.02,P<0.05)顯著升高；與B組比較，C組和D組NF-κB mRNA水平(1.69±0.22，0.91±0.18)均顯著降低，且D組更顯著(均P<0.05)。見圖4。

3 討 論

糖尿病并發癥嚴重影響患者的生活質量，而長期的高血糖又可導致機體微炎性反應加劇，損害肺功能〔4,5〕。Kopf等〔6〕研究指出，糖尿病前期及糖尿病患者中限制性通氣功能障礙者所占比例較高，主要表現為肺通氣功能障礙、小氣道功能障礙及彌散功能障礙，且肺彌散功能下降與全身微血管病變相一致〔7〕。研究表明TGF-β1/p38MAPK參與組織纖維化的發生與發展〔8,9〕。TGF-β1被認為是促纖維化形成的重要細胞因子〔10〕。TGF-β1可由所有類型的細胞及浸潤的炎性細胞分泌，反過來也參與纖維化的各個環節，包括刺激細胞外基質合成、抑制細胞外基質降解；刺激上皮細胞轉化為肌纖維細胞，促細胞與基質黏附增強，促細胞外基質沉積〔11〕。FN是細胞外基質的重要成分，其含量增多是肺纖維化進展的重要指標。TGF-β1可特異性磷酸化和激活 p38MAPK信號通路，促進細胞增殖和遷移，p38MAPK在肺纖維化成纖維細胞中過度激活，使細胞膠原合成增加，最終導致肺纖維化〔12,13〕。NF-κB是p38MAPK下游信號分子，包括p65、 c-ReI、ReIB、p50和p52 5種亞型，各亞型之間相互組合形成二聚體〔14〕。NF-κB作為p38MAPK 下游信號分子，p38MAPK 活化后能激活 NF-κB 信號通路，促使 NF-κB 進入細胞核調控下游靶基因發揮作用〔15〕。

本研究通過基因和蛋白水平驗證，糖尿病大鼠肺組織TGF-β1、FN水平明顯增加，肺組織發生纖維化。其機制可能與TGF-β1/p38MAPK信號通路的活化相關。糖尿病大鼠肺組織p38MAPK、NF-κB表達升高，提示TGF-β1/p38MAPK信號傳導通路活化增加，上調了NF-κB，增加了糖尿病大鼠肺纖維化的發生和發展。而經過達格列凈治療后，特別是在血糖不在繼續下降的情況下，TGF-β1、FN表達量仍較前下降，考慮抑制了TGF-β1/p38MAPK信號通路，下調了NF-κB的表達。綜上，TGF-β1/p38MAPK信號傳導通路可能是導致糖尿病大鼠肺損傷的重要途徑之一。達格列凈其效應機制可能是抑制了TGF-β1/p38MAPK 信號通路的活化，發揮了抗纖維化的作用。

糖尿病患者血糖及并發癥的控制有效改善糖尿病患者生活質量。筆者推測，達格列凈改善糖尿病肺纖維化的作用可能是多靶點的，通過調控 TGF-β1/p38MAPK 通路活性來減少細胞外基質的沉積，抑制肺組織發生纖維化來發揮肺組織保護作用。綜上，達格列凈預防和治療糖尿病肺纖維化可能將是今后臨床研究的一個重要方向。在糖尿病并發癥的治療和預防方面，TGF-β1/p38MAPK信號通路可能也可作為特異性的干預靶點。