BRD4抑制劑JQ1及miR-141對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制

郭曉波 趙宇峰 趙波 李崗

(長治醫學院附屬和濟醫院泌尿外科，山西 長治 046011)

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤類型，每年有57.3萬新增病例，并導致超過21萬人死亡〔1，2〕。手術和化療是膀胱癌的主要治療策略，但因其高復發率和遠處轉移率，導致治療效果并不理想。因此，亟待尋找新型有效膀胱癌治療方法。微小RNA(miRNA)是非編碼、短鏈、單鏈RNA分子，其通過結合靶mRNA 3′非翻譯區來調節目標蛋白表達，進而調節與腫瘤細胞增殖、侵襲、炎癥反應和細胞凋亡相關的細胞信號通路，特定miRNA表達失調與腫瘤進展相關〔3〕。研究指出miR-141表達水平與膀胱癌腫瘤分級、分期及轉移、預后情況存在相關性〔4，5〕。miR-141靶向runt相關轉錄因子(RUNX)3調控腫瘤細胞增殖和凋亡〔6〕。溴結構域蛋白(BRD)4是溴域外(BET)蛋白家族成員，其在惡性腫瘤中過度表達〔7〕。JQ1是一種BRD4選擇性抑制劑，其通過誘導細胞凋亡和周期阻滯來抑制膀胱癌等多種實體瘤進展〔8，9〕。本研究探討BRD4抑制劑JQ1聯合下調miR-141對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響及潛在分子機制，以期為臨床治療膀胱癌提供新型策略。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1組織來源 90例膀胱癌組織及與之配對的癌旁組織取自2018年1月至2019年12月長治醫學院附屬和濟醫院確診為膀胱癌并行手術的患者，男72例，女18例，年齡61～80歲，中位年齡70歲。納入標準：術前未接受抗腫瘤治療；未合并其他惡性腫瘤。所有患者在使用臨床材料前簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準。

1.1.2細胞和試劑 人膀胱癌細胞RT-4、改良Eagle培養基(DMEM)培養基、青鏈霉素、胎牛血清購自武漢普諾賽生命科技公司；miScript逆轉錄試劑盒購自德國QIAGEN公司；熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自美國Roche公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物生物技術公司；CCK-8試劑盒購自上海吉滿生物科技公司；兔源激活型天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白(caspase)-3單克隆抗體(AC033)、兔源B細胞淋巴瘤(Bcl)-2多克隆抗體(AB112)、兔源Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體(AF1270)、兔源蛋白激酶B(AKT)單克隆抗體(AF1777)、兔源β-actin單克隆抗體(AF5003)購自上海碧云天生物公司；兔源磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)多克隆抗體(ab226826)、羊抗兔二抗(ab205718)、兔源p-PI3K多克隆抗體(ab182651)、兔源p-AKT多克隆抗體(ab38449)購自上海艾博抗生物公司。

1.2RT-qPCR檢測膀胱癌中miR-141表達 Trizol法提取組織樣本的總RNA，用miScript逆轉錄試劑盒合成cDNA，根據熒光定量PCR試劑盒配制反應體系進行RT-qPCR。U6作為miRNA的內參，采用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.3細胞培養和分組 RT-4細胞接種于含1%青鏈霉素、1%胎牛血清的DMEM培養基，放入含95%空氣、5% CO2、37℃培養箱孵育。在24孔板接種對數期RT-4細胞，Lipo 2000轉染anti-miR-141、anti-miR-NC，用Opti-MEM培養基進行轉染，培養4～6 h后用DMEM培養基代替，收集轉染48 h細胞備用。用不同濃度(0.003 2、0.016 0、0.080 0、0.400 0、0.800 0、2.000 0、10.000 0 μmol/L)的JQ1處理RT-4細胞48 h，CCK-8法檢測細胞存活率，計算IC50值為0.791，后續用0.800 0 μmol/L的JQ1進行下一步實驗。正常培養的RT-4細胞為對照(Control)組；用含0.800 0 μmol/L JQ1的培養液孵育RT-4細胞48 h，記為JQ1組；轉染anti-miR-141的RT-4細胞記為anti-miR-141組；用含0.800 0 μmol/L JQ1的培養液孵育轉染anti-miR-NC、轉染anti-miR-141的RT-4細胞48 h，記為JQ1+anti-miR-NC組、JQ1+anti-miR-141組。

1.4CCK-8法檢測細胞增殖活力 將未轉染RT-4細胞、轉染RT-4細胞分別接種96孔板，根據1.3分組給予對應劑量的JQ1處理，孵育24、48、72 h時，用含10% CCK-8試劑的培養液替換原培養液，孵育2 h后，在450 nm處測量所有樣品的光密度(OD)。

1.5集落形成實驗檢測細胞克隆能力 收集各組細胞并清洗，以1×103個/孔接種6孔板，培養14～16 d直到出現細胞集落，用70%乙醇固定細胞集落，然后用結晶紫溶液染色。計數50個以上細胞的集落數表示為克隆形成數。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組細胞并清洗，用Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。染色后，所有標本立即在FACSort流式細胞儀上進行檢測，用Cell Quest3.0軟件分析數據。

1.7Western印跡法檢測PI3K/AKT通路和凋亡相關蛋白表達 收集各組細胞并清洗，將RIPA裂解液加入沉淀中，超聲破碎細胞，離心吸取上清，獲得蛋白樣品。根據蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合沸水孵育5 min，使蛋白質變性。加樣后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(80 V，30 min；100 V 60 min)，恒定電流轉膜(220 mA，60 min)，然后將膜放入含5%脫脂牛奶中封閉1 h。按照抗體說明書稀釋一抗和二抗，在室溫下分別孵育膜2 h。滴適量電化學發光(ECL)液于膜上，用凝膠成像儀曝光，通過Image J軟件采集圖像，計算目的條帶相對于內參β-actin的灰度值。

1.8統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-141在癌組織和癌旁組織中的表達情況 膀胱癌組織中miR-141表達水平(2.33±0.36)顯著高于癌旁組織(1.00±0.12；t=33.250,P<0.000 1)。

2.2BRD4抑制劑JQ1對膀胱癌細胞存活率的影響 用不同濃度(0.003 2、0.016 0、0.080 0、0.400 0、0.800 0、2.000 0、10.000 0 μmol/L)的JQ1處理RT-4細胞48 h，CCK-8法檢測細胞存活率分別為(100.00±3.11)%、(95.36±7.22)%、(88.36±7.05)%、(73.47±6.27)%、(49.19±5.23)%、(37.33±4.04)%、(25.19±3.04)%，計算IC50值為0.791，選擇0.800 0 μmol/L的JQ1進行后續實驗。

2.3BRD4抑制劑JQ1聯合anti-miR-141對膀胱癌細胞增殖的影響 與轉染anti-miR-NC(1.00±0.12)比較，轉染anti-miR-141后RT-4細胞miR-141表達(0.24±0.05)顯著降低(P<0.05)，表明轉染anti-miR-141可抑制miR-141表達。與Control組比較，JQ1組、anti-miR-141組RT-4細胞活力(24 h、48 h、72 h)顯著降低(P<0.05)；與JQ1+anti-miR-141組比較，anti-miR-141組、JQ1組、JQ1+anti-miR-NC組RT-4細胞活力(48 h、72 h)顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 JQ1聯合anti-miR-141對膀胱癌細胞OD值的影響

2.4BRD4抑制劑JQ1聯合anti-miR-141對膀胱癌細胞菌落形成的影響 Control組、JQ1組、anti-miR-141組、JQ1+anti-miR-NC組、JQ1+anti-miR-141組克隆數分別為(346.56±41.16)個、(237.67±16.33)個、(212.22±28.77)個、(259.11±28.62)個、(148.00±13.88)個；與Control組比較，JQ1組、anti-miR-141組RT-4細胞克隆形成數顯著減少(P<0.05)；與JQ1+anti-miR-141組比較，anti-miR-141組、JQ1組、JQ1+anti-miR-NC組RT-4細胞克隆形成數顯著增加(P<0.05)，見圖1。

2.5BRD4抑制劑JQ1聯合anti-miR-141對膀胱癌細胞凋亡的影響 與Control組比較，JQ1組、anti-miR-141組RT-4細胞凋亡率及Cl-caspase-3、Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與JQ1+anti-miR-141組比較，anti-miR-141組、JQ1組、JQ1+anti-miR-NC組RT-4細胞凋亡率及Cl-caspase-3、Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2和圖3。

2.6BRD4抑制劑JQ1聯合anti-miR-141對膀胱癌細胞PI3K/AKT通路的影響 蛋白免疫印跡檢測相關蛋白表達與Control組比較，JQ1組、anti-miR-141組RT-4細胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與JQ1+anti-miR-141組比較，anti-miR-141組、JQ1組、JQ1+anti-miR-NC組RT-4細胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見表2和圖3。

3 討 論

miRNA通過與不同的靶基因結合參與調控腫瘤生長、轉移等癌癥進展多個環節，在人類癌癥防治中具有潛在重要臨床價值〔10〕。研究報道肝癌中miR-141表達下降，上調miR-141可影響肝癌細胞周期分布和凋亡，抑制體外增殖活力和遷移能力〔11〕。青藤堿通過下調lncRNA MALAT1表達、上調miR-141表達來抑制胃癌細胞惡性表型〔12〕。然而，miR-141在結腸癌中表達增加，可能作為癌基因參與結腸癌進展和轉移過程，是結腸癌早期診斷和基因治療的新靶點〔13，14〕。與之前研究結果一致〔5，6〕，本研究結果表明膀胱癌組織中miR-141表達增加，下調miR-141表達可抑制RT-4細胞增殖活力和克隆形成能力，誘導細胞凋亡，證實miR-141在膀胱癌中的致癌功能。BRD4抑制劑JQ1對多種人類癌癥具有抑制作用，研究報道JQ1可阻止腎癌細胞增殖和上皮間質轉化進展，誘導caspase-1依賴性細胞焦亡〔15〕。JQ1通過能力減弱DNA修復來增加宮頸癌細胞對放射治療的敏感性〔16〕。JQ1聯合阿霉素能夠抑制骨肉瘤細胞生長，并誘導骨肉瘤細胞凋亡〔17〕。本研究發現JQ1可抑制RT-4細胞增殖活力，誘導細胞凋亡，與譚益帆等〔8〕研究結果吻合。JQ1與下調miR-141表達的抗腫瘤作用一致，本研究結果表明，JQ1聯合下調miR-141具有更強的腫瘤抑制作用。Bcl-2家族蛋白通過調節線粒體外膜通透性、膜電位喪失水平，誘導細胞色素C的釋放，促進凋亡復合物形成，激活caspase-9，Cl-caspase-9隨后激活caspase-3，最終誘導凋亡過程〔18，19〕。本研究表明JQ1聯合下調miR-141在膀胱癌中協同發揮抗腫瘤作用。

PI3K/AKT通路在信號轉導調節中起重要作用，其介導腫瘤細胞增殖、代謝、凋亡和血管生成等多種生物學過程〔20，21〕。PI3K/AKT通路的過度激活與膀胱癌細胞快速生長、腫瘤進展和多藥耐藥密切相關〔20，22〕。研究報道JQ1通過PI3K/AKT通路誘導膠質瘤干細胞的周期停滯和凋亡〔23〕。本研究結果表明，JQ1聯合下調miR-141可能通過抑制PI3K/AKT通路協同發揮抗膀胱癌作用。

綜上，BRD4抑制劑JQ1聯合下調miR-141可抑制膀胱癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，其機制可能與抑制PI3K/AKT通路有關。因此，BRD4抑制劑JQ1聯合下調miR-141可能是一種潛在有效的膀胱癌治療策略。