直腸腔內三維超聲聯合FHIT、Apollon 蛋白對老年直腸癌患者壁外血管侵犯及預后的評估價值

楊勇 何開強 文云波

(遵義醫科大學第三附屬醫院(遵義市第一人民醫院)肛腸科，貴州 遵義 563000)

直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，全球每年新發直腸癌病例約600萬，發病率和死亡率均位居前列〔1〕。老年人是直腸癌的高發群體，存在較多的基礎疾病，加之直腸癌起病隱匿，早期癥狀不典型，多數患者確診時已出現遠處轉移〔2〕。相關研究顯示，壁外血管侵犯是直腸癌轉移、局部復發、不良預后的獨立危險因素〔3〕。術前準確評估直腸癌患者壁外血管侵犯情況對治療方案的制定具有重要價值。目前臨床主要采用磁共振成像進行直腸癌術前壁外血管侵犯的評估，但準確性仍需進一步提升〔4〕。直腸腔內三維超聲主要用于評估直腸癌患者的T分期和N分期，評估壁外血管侵犯的相關研究仍十分少見。脆性組氨酸三聯體(FHIT)基因在胃癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達，與腫瘤細胞轉移和侵襲相關〔5〕。凋亡抑制蛋白Apollon過表達會促進腫瘤細胞轉移，參與腫瘤的發生與發展〔6〕。本研究旨在探討直腸腔內三維超聲聯合FHIT、Apollon 蛋白對老年直腸癌患者壁外血管侵犯及預后的評估價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年1～12月遵義醫科大學第三附屬醫院老年直腸癌患者85例。入選標準：①無手術禁忌證，接受直腸癌根治術治療；②術后病理檢查確診為直腸癌；③術前10 d內行直腸腔內三維超聲檢測；④術后留取病理標本，隨訪治療和臨床資料完整。排除標準：①術前有放化療等抗治療史；②存在其他部位原發性腫瘤；③精神異常，無法配合隨訪。其中男50例，女35例；年齡60～81歲，平均(71.56±5.14)歲。本研究經醫院倫理委員會審批通過，患者自愿參與并簽署知情同意書。

1.2直腸腔內三維超聲檢查 使用彩色多普勒超聲診斷儀進行直腸腔內三維超聲檢查，腔內3D探頭頻率分別為6、9、12 MHz。檢查前2 h進行腸道準備，患者腸道清潔完成后行側臥位肛門指檢，判斷腫瘤病灶的質地、位置、解剖學結構等，使用一次性灌注器皿注入100 ml無菌耦合劑，超聲探頭保護套后進入肛門至腫瘤病灶位置，觀察病變浸潤深度、體積大小、周圍組織淋巴結個數。三維立體成像后觀察腫瘤病灶周圍是否有擴張血管或異常走行及血流充盈情況。直腸癌壁外血管侵犯的診斷按照Smith等〔7〕提出的評估標準，0分：非結節狀腫瘤侵至腸壁肌層；1分：結節狀腫瘤侵出腸壁；2分：腫瘤周邊有供血血管，但血管輪廓無異常，且無血管狹窄和擴張，無異常實性信號；3分：腫瘤周圍血管中有異常回聲，血管輪廓略微擴張，或有輕微血管狹窄和擴張；4分：腫瘤周圍血管中有異常回聲，血管輪廓不規則擴張。3～4分者需要聯合血管內血流充盈情況；0～2分診斷為壁外血管侵犯陰性，3～4分診斷為壁外血管侵犯陽性。

1.3FHIT 和Apollon 蛋白表達檢測 收集老年直腸癌患者癌組織和距離腫瘤病灶約3 cm的癌旁組織，均使用10%中性甲醛溶液固定，剪成邊長為1 cm的組織塊，梯度乙醇脫水，二甲苯固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片。將切片脫蠟至水，熱修復抗原，3%過氧化氫孵育后，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，轉入封閉液中封閉。每張切片中均加入鼠抗人FHIT 多克隆抗體(1∶500稀釋)，鼠抗人Apollon 多克隆抗體(1∶500稀釋)，37℃條件下孵育2 h，滴加生物素標記的山羊抗鼠IgG，1∶2 000稀釋，37℃條件下孵育30 min，二氨基聯苯胺法顯色，蘇木精復染，封片后再光學顯微鏡下觀察。高倍鏡視野下隨機選取切片的5個視野，根據染色強度分為：無色0分、黃色1分、棕黃色2分、褐色3分；根據陽性細胞比例分為：無陽性細胞0分、≤10%及1分、10%～50% 2分、51%～75% 3分、>75% 4分。染色強度與陽性細胞比例乘積≤1為陰性，≥2為陽性。

1.4資料收集及隨訪觀察 收集患者性別、年齡、T分期、N分期、分化程度、癌胚抗原水平及術后病理診斷壁外血管侵犯情況。手術治療后對患者進行3年隨訪，采用門診復查結合電話隨訪的方式進行，記錄患者生存時間。

1.5統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行Kappa分析、χ2檢驗、受試者工作特征(ROC)曲線分析和Kaplan-Meier曲線分析。

2 結 果

2.1不同臨床病理特征老年直腸癌患者壁外血管侵犯情況比較 不同年齡、T分期、N分期、分化程度、癌胚抗原水平血管侵犯陽性率差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 不同臨床病理特征老年直腸癌患者壁外血管侵犯情況比較〔n(%)〕

2.2直腸腔內三維超聲對老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷分析 以術后病理結果為診斷血管侵犯的金標準，71例術后病理結果血管侵犯陰性患者中直腸腔內三維超聲正確診斷68例，誤診3例；14例術后病理結果血管侵犯陽性患者中直腸腔內三維超聲正確診斷10例，誤診4例；直腸腔內三維超聲診斷老年直腸癌患者壁外血管侵犯的準確率為91.76%(Kappa=0.752，P=0.005)。

2.3FHIT 蛋白對老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷分析 71例術后病理結果血管侵犯陰性患者中FHIT 蛋白陰性66例，誤診5例；14例術后病理結果血管侵犯陽性患者中FHIT 蛋白陽性8例，誤診6例；FHIT 蛋白陽性診斷老年直腸癌患者壁外血管侵犯的準確率為87.05%(Kappa=0.692，P=0.010)。

2.4Apollon 蛋白對老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷分析 71例術后病理結果血管侵犯陰性患者中Apollon蛋白陰性63例，誤診8例；14例術后病理結果血管侵犯陽性患者中Apollon 蛋白陽性8例，誤診6例；Apollon蛋白陽性診斷老年直腸癌患者壁外血管侵犯的準確率為83.53%(Kappa=0.657，P=0.018)。

2.5不同臨床病理特征老年直腸癌患者FHIT和Apollon 蛋白陽性表達比較 不同年齡、T分期、N分期、分化程度、癌胚抗原水平FHIT和Apollon蛋白陽性率差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表2。

表2 不同臨床病理特征老年直腸癌患者FHIT和Apollon 蛋白陽性表達情況比較〔n(%)〕

2.6直腸腔內三維超聲及FHIT、Apollon 蛋白對老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷效能分析 ROC曲線分析顯示，直腸腔內三維超聲、FHIT蛋白、Apollon 蛋白單獨和聯合檢測對老年直腸癌患者壁外血管侵犯均具有較高的診斷價值(P<0.05)；其中直腸腔內三維超聲及FHIT、Apollon 蛋白聯合檢測的診斷價值最高(AUC=0.836)，靈敏度明顯高于各指標單獨檢測。見圖1、表3。

表3 直腸腔內三維超聲及FHIT、Apollon 蛋白對老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷價值分析

2.7老年直腸癌患者3年生存情況的Kaplan-Meier曲線分析 直腸腔內三維超聲、FHIT蛋白、Apollon 蛋白陽性的老年直腸癌患者3年生存率明顯低于直腸腔內三維超聲、FHIT蛋白、Apollon 蛋白陰性者(Log-rankχ2=13.481、10.635、9.873，均P<0.05)。見圖2。

3 討 論

研究者顯示壁內血管與壁外血管區別后，直腸癌壁外血管侵犯是固有肌層外的脈管細胞中有腫瘤細胞侵犯，該類患者5年生存率低于30%〔8〕。相關研究顯示，直腸癌壁外血管侵犯陰性者治療后長期生存率明顯高于陽性患者〔9〕。磁共振成像是術前評估壁外血管侵犯的主要手段，但臨床應用中發現，磁共振成像檢出的壁外血管侵犯患者明顯多于組織病理學〔10〕，提示仍需要探索補充診斷壁外血管侵犯的治療來提高診斷的準確性。直腸腔內三維超聲檢查多用于直腸癌患者T分期和N分期評估，在早期直腸癌患者病情評估中有較高準確性〔11〕。但關于直腸腔內三維超聲評估直腸癌患者術前壁外血管侵犯的研究仍較為少見。

FHIT蛋白屬于三聯組氨酸家族，在人體多個組織器官中均有表達〔12〕。相關研究顯示，胃癌、結直腸癌組織中FHIT蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織〔13〕，提示FHIT蛋白過表達與惡性腫瘤的發生、發展密切相關。Apollon蛋白是凋亡抑制蛋白家族成員，屬于該家族中分子量最大的蛋白，其結構中的特殊序列BIR能夠與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9、線粒體促凋亡蛋白結合后促進其降解，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9前體活化，降低凋亡信號啟動效率，腫瘤細胞無限生長，轉移風險明顯增加〔14〕。本研究結果提示FHIT、Apollon蛋白表達異常升高能夠促進直腸癌細胞的轉移和侵襲，進而提高老年直腸癌患者壁外血管侵犯的發生風險。

FHIT 能夠通過線粒體依賴凋亡蛋白酶和死亡受體途徑抑制細胞凋亡，但具體的分子機制仍未完全明確，與Apollon蛋白表達存在一定相關性〔15〕，同時FHIT、Apollon蛋白表達與腫瘤患者的臨床病理特征可能存在相關性〔16〕。本研究結果提示FHIT、Apollon蛋白表達與老年直腸癌患者的臨床病理特征密切相關，可能用于患者的預后評估。ROC曲線分析對老年直腸癌患者壁外血管侵犯的診斷效能結果顯示，直腸腔內三維超聲及FHIT、Apollon 蛋白聯合檢測的診斷效能最高。研究者采用siRNA法下調乳腺癌細胞中Apollon 基因表達，結果顯示，乳腺癌細胞對鉑類的敏感性明顯增強〔17〕，說明Apollon 表達與乳腺癌的治療轉歸存在相關性。本研究證實了直腸腔內三維超聲檢查結果及FHIT、Apollon 蛋白表達與患者預后密切相關，可作為預測老年直腸癌患者預后的可靠指標用于臨床治療。