微量元素Fe、Co、Ni對養殖糞污厭氧發酵產氣性能及微生物群落結構影響

＊韋采妮 趙晨菊 黃河笑 李顯芳 萬巧玲 余薇薇*

（1.重慶交通大學河海學院水利水運工程教育部重點實驗室 重慶 400074 2.國家城市供水水質監測網重慶監測站 重慶 400060 3.重慶市渝東水務有限公司 重慶 404000）

我國畜禽養殖業發展迅速，2013年重慶市養豬當量411.81萬頭，糞便產量達226.93萬噸[1]。大量畜禽糞便帶來了較嚴重的農業面源污染問題，厭氧發酵工藝具有良好的生物降解性能，作為農村消納畜禽糞便，實現畜禽糞污無害化、資源化處理的有效途徑，可將各種有機物轉化為CH4和CO2，獲得可再生生物燃料。富含營養物質的消化沼液可作為肥料施用，改良農田和土壤。豬糞中有機質含量、TN、TP等達24.16%、2.65%、0.68%，具有較高的沼氣生產潛力[2]。但厭氧發酵工藝存在原料利用率低、易出現酸化和氨氮抑制等問題。通過添加Fe、Co、Ni、Mo元素，改善了食物廢棄物厭氧發酵系統的穩定性和提高發酵性能[3]，微量元素缺乏是造成厭氧發酵性能差的首要原因。

微量元素是微生物生長不可缺少的營養物質，產甲烷菌生長到1.32g/L左右時會缺Fe，而產甲烷菌生長到4.830g/L和30g/L時則會相應缺乏Ni和Co等元素[4]。此前的研究厭氧發酵工藝性能優化主要集中于對有機污染物的去除效率，且多為單一元素投加作用。因此，本次研究比較一定濃度的單一和混合元素對豬糞厭氧發酵系統中產氣性能微生物群落的影響。研究結果可為提高豬糞厭氧發酵性能提供理論借鑒。

1.材料與方法

(1)樣品采集與接種

豬糞取自重慶市農戶和養豬場，接種污泥取自污水處理廠厭氧池，接種前將馴化好的接種污泥在70～90℃條件下經2h熱處理，降低產甲烷菌的活性。稱取一定量糞污、接種污泥與蒸餾水攪拌均勻，使發酵濃度調整為6.0% VS，初始pH調至中性，將配制發酵底物加入厭氧發酵罐中，溫度設定為37.0±0.5℃，攪拌速率設置為120r/min。

(2)實驗設計

①微量元素對厭氧發酵產氣影響

根據前實驗確定厭氧發酵系統促進COD降解最佳微量元素投加量，微量元素以水溶液形式加入，實驗設置五組：實驗Ⅰ為空白組；實驗Ⅱ單一Fe（FeCl2·4H2O）元素10mg/L；實驗Ⅲ單一Co（CoCl2·6H2O）元素1.5mg/L；實驗Ⅳ單一Ni（NiCl2·6H2O）元素0.8mg/L；實驗Ⅴ混合Fe、Co、Ni，投加量分別為9mg/L、1mg/L和0.7mg/L。

②微量元素對厭氧發酵微生物群落影響

采集產氣高峰期添加不同微量元素的厭氧發酵罐中污泥，采集的樣品經10000rpm離心10min，去除上清液，-80℃液氮保存送至上海美吉生物技術有限公司。

(3)分析方法

產氣量采用排飽和食鹽水法測定；樣品DNA使用Fast DNA?SPIN Kit for Soil試劑盒提取；使用細菌和古菌的通用引物515FmodF（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）和806RmodR（GGACTACNVGGGTWTCTAAT），針對16SrRNA基因的V4區進行PCR擴增。擴增條件為：95℃下初期變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃下延伸45s，循環26次；72℃下延伸10min。純化產物進行MiSeq高通量測序，使用QIME1.9進行數據分析。

2.結果與分析

(1)產氣特性

添加單一Co、Ni和混合Fe、Co、Ni厭氧發酵沼氣日產量和累積產量均高于對照組，發酵第30天結束時，累積產氣量與對照組相比分別提高了1.18倍、1.69倍和1.85倍。添加單一10mg/L Fe略低于對照組，但累積產氣曲線還呈上升趨勢，推測添加單一Fe元素組還未發酵完全。有報道指出50～4000mg/L濃度的Fe2+有利于沼氣的產生[5]，說明促進COD降解與促進厭氧發酵產氣的微量元素有效添加量有一定差異。Zhang等[6]研究發現在厭氧發酵后期Fe2+的添加會抑制纖維素酶的活性，產氣量低于未添加Fe2+組。微量元素的補充量與發酵基質、接種物以及裝置的運行方式有關，發酵裝置和發酵物不同參與各階段產氣途徑所需輔酶的比列會發生變化。單一微量元素中，Ni元素對產沼氣的促進作用優于Fe元素和Co元素，這可能對Ni元素在甲烷過程中參與CO脫氫酶、輔酶F430和甲基-輔酶M還原酶等的合成與催化起著關鍵作用[7]。單一微量元素對產氣量的促進效果低于混合微量元素，這可能是因為混合元素之間產生協同作用。

(2)微生物群落多樣性與結構特性

①微生物多樣性

經高通量測序，在OTUs為97%序列相似性水平下采用豐富度指數（Ace、Chao1）、多樣性指數（Shannon、Simpson）和深度指數（Coverage）對樣品中微生物群落進行分析，分析結果如表1。發酵產氣高峰期時的5個樣品的測序Coverage指數值均達99%，可全面有效解析發酵體系中微生物群落變化情況。Ace和Chao1指數可以反映微生物群落豐富度，同時Shannon指數越大和Simpson指數越小表示微生物群落的多樣性越高。隨著Fe、Co、Ni元素的投加，Ace、Chao1和Shannon指數均大于空白組，且Simpson指數均小于空白組，說明添加Fe、Co、Ni元素增加了厭氧發酵系統中微生物豐富度和多樣性。

表1 Illumina測序數據統計分析

(3)微生物群落結構

厭氧發酵過程通過多種微生物協調配合作用，經過水解、產氫產酸和產甲烷階段，最終產生沼氣，厭氧發酵系統的產氣性能與微生物群落結構密切相關。在門類水平上，主要優勢菌種為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、廣古菌門。微生物發酵產沼氣主要為產氫產酸和產甲烷階段。變形菌門主要用于降解粗蛋白質為小分子物質，以供產酸和產甲烷階段微生物分解轉化，同時能夠促進糞便中碳氮的轉化[8]，添加單一Fe元素組的變形菌門占14.09%，相比空白組提高了7.59%，Fe元素的投加有助于變形菌門的生長。有研究指出厚壁菌門在富含纖維素底物中較為豐富，將木質纖維素降解為有機酸，是水解酸化階段主要細菌群[9]，添加單一Fe元素、Co元素、Ni元素和混合Fe、Co、Ni元素的厚壁菌門豐度分別比空白實驗組提高了6.41%、10.46%、11.23%和7.55%，微量元素的投加促進發酵系統中的厚壁菌門豐度增大。而擬桿菌門參與木質纖維素和多糖的利用，可在厭氧發酵過程中將有機物轉化為乙酸[10]，微量元素投加組擬桿菌門豐度明顯降低，表明微量元素對擬桿菌門具有抑制作用。

在屬水平上，主要以梭菌屬、土耳其螺屬、產芽胞厭氧菌和固氮菌為主，優勢菌屬相對豐度在各實驗組中差別不大，不同微量元素對產甲烷菌的影響較大，產甲烷菌與甲烷產量存在密切關系，各實驗組的古菌主要為甲烷短桿菌和甲烷八疊球菌。甲烷短桿菌和甲烷八疊球菌分別屬于氫營養型產甲烷菌、乙酸營養學產甲烷菌，可促進氫營養化和乙酸分解產甲烷作用。添加Fe、Co、Ni和混合Fe、Co、Ni元素甲烷短桿菌比例分別提高了1.14%、0.59%、1.23%、3.76%。各實驗組甲烷八疊球菌比例分別為0.49%、0.28%、0.44%、0.35%和1.46%，投加混合元素協同作用可促進甲烷八疊球菌的生長，而微量的Fe、Ni元素對甲烷八疊球菌的增長表現出輕微的抑制，投加微量元素使產甲烷菌群落呈產乙酸營養型富集。因此投加Fe、Co、Ni元素對主要優勢菌群種類沒有影響，但優勢菌群的總占比有明顯提高，有利于水解產酸菌群和產甲烷菌群的繁殖和群落結構的穩定，提高了發酵系統的穩定性和產氣性能。

3.結論

（1）添加一定濃度微量元素可以提高養豬糞污厭氧發酵中沼氣的產量，混合Fe、Co、Ni元素的協同作用，對于促進厭氧發酵產氣效果最優，有效促進了厭氧發酵的啟動和產氣高峰提前出現，加速厭氧發酵的進程。

（2）微量Fe、Co、Ni元素的添加增加了微生物群的豐度和多樣性，刺激優勢菌群的生長和繁殖，從而提高厭氧發酵沼氣產速率與產氣量。