雷公藤甲素通過調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1/p53途徑抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和遷移

周星言， 戴國瑤

1.連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 連云港 222000；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，手術(shù)及放化療是其治療的主要方式，然其術(shù)后復(fù)發(fā)率高，對臨床常用化療藥物不敏感且存在一定的毒副作用，臨床療效不盡滿意。因此，找尋低毒性、高效且對腫瘤細(xì)胞具有靶向作用的抗腫瘤藥物及新的治療靶點是當(dāng)前研究的熱點。雷公藤甲素是提取自雷公藤的一種天然二萜類活性成分，近年大量體內(nèi)外研究證實，其能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及自噬，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，介導(dǎo)腫瘤免疫、抑制腫瘤血管生成，對人類多種腫瘤具有良好的抗腫瘤活性[1-2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一種高度保守的煙酰腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的去乙酰化酶，與多種重要轉(zhuǎn)錄因子及染色質(zhì)或轉(zhuǎn)錄共調(diào)控因子相互作用，通過對組蛋白的去乙酰化作用在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)行為[3-4]。研究證實，p53是SIRT1的非組蛋白作用底物，也是SIRT1的主要靶蛋白，SIRT1激活可使p53蛋白去乙酰化，降低p53穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)依賴于p53的促凋亡基因轉(zhuǎn)錄抑制，從而抑制細(xì)胞凋亡[5]，可見SIRT1/p53通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。有研究表明，miR-204通過抑制SIRT1表達(dá)，可促進(jìn)p53乙酰化，調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為，增強阿霉素耐藥敏感性[6]。SIRT1通過調(diào)控p53、叉頭框蛋白O1(forkhead box O1，F(xiàn)oxO1)等重要的自噬組分誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[7]。白藜蘆醇通過DJ-1介導(dǎo)的SIRT1/p53通路可減輕心肌缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]。基于目前有關(guān)雷公藤甲素與SIRT1/p53通路在肝癌中的作用機制研究報道極少，因此本研究擬探究雷公藤甲素對肝癌細(xì)胞增殖、遷移的作用及其與SIRT1/p53通路間的相關(guān)性，以期為肝癌的臨床治療提供更多的參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞及培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長至90%時，用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞傳代，用于實驗。

1.2 藥品、試劑及儀器雷公藤甲素(純度≥98%)購自成都普思生物科技股份有限公司；Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(CAS號：67-68-5)購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(CAS號：9002-07-7)購自美國Gibco公司；qRT-PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京凱基生物公司；Transwell 小室、細(xì)胞培養(yǎng)板購自Coming Costar公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek公司；CCK-8試劑盒、RNA提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物公司；SIRT1、p53、乙酰化p53(acetylated p53, Ac-p53)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自英國Abcam公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力：取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞以6×103個/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁過夜后，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果分別加入終濃度為50、100、200 nmol/ml的雷公藤甲素培養(yǎng)12、24、48 h，同時設(shè)置空白對照組(不做任何處理)，每組設(shè)6個復(fù)孔；作用結(jié)束后每孔加入10 μl的CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測各組吸光度值(A值)，實驗重復(fù)3次，計算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。

1.3.2 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力：取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁12 h后加藥(同上)培養(yǎng)24 h，消化細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，制成單細(xì)胞懸液；將Transwell小室放入24孔板，上室加入單細(xì)胞懸液200 μl,下室加入含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的完全培養(yǎng)基500 μl，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，用棉簽擦拭多余細(xì)胞并擦干，4%多聚甲醛固定15 min，取出小室，質(zhì)量濃度為50 g/L的結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，于鏡下(放大200倍)隨機選取5個視野觀察、拍照，計數(shù)染色穿膜細(xì)胞數(shù), 實驗重復(fù)3次取平均值。

1.3.3 qRT-PCR檢測SIRT1、p53 mRNA表達(dá)：取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h后，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板配置PCR反應(yīng)體系，選取GAPDH為內(nèi)參行qRT-PCR擴增反應(yīng)；引物序列，SIRT1上游：5′-TACAGAGCGTGCAAGAGCTTG-3′，下游：5′-GCTTTGAT

AGTACGAAGGCG-3′；p53上游：5′-GGCCAGACAGCAA

GACAATGT-3′，下游：5′-TATGCCGCGAGCTACACTGAC-3′；GAPDH上游：5′-TTCGGTTATAGCGTTTGTT-3′，下游：5′-TCTGACGTTCACGCTTGC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達(dá)。

1.3.4 蛋白免疫印跡(Western blotting)檢測通路相關(guān)蛋白表達(dá)：取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞以2×106個/孔接種于6孔板培養(yǎng)24 h，加藥(同上)培養(yǎng)2 h，加入RIPA裂解液收集細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行細(xì)胞蛋白樣品定量、變性；取50 μg蛋白樣品SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA封閉1 h，洗膜，分別加入SIRT1、p53、Ac-p53一抗(稀釋倍數(shù)1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，繼續(xù)孵育1 h，PBS洗膜，加入ECL發(fā)光液暗室成像，采用AlphaEaseFC 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素對HepG2細(xì)胞增殖的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示：隨著雷公藤甲素濃度升高和作用時間延長，各作用組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)，呈時間-劑量依賴性，其中200 nmol/ml雷公藤甲素作用48 h時細(xì)胞抑制率最明顯(見圖1)。

2.2 雷公藤甲素對HepG2細(xì)胞遷移的影響Transwell遷移實驗檢測顯示，與空白對照組相比，隨著雷公藤甲素作用濃度升高，各作用組細(xì)胞遷移數(shù)量劑量依賴性逐漸降低(P<0.05)(見圖2)。

注：與12 h相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與50 nmol/ml組相比，#P<0.05；與100 nmol/ml組相比，&P<0.05。

2.3 雷公藤甲素對SIRT1、p53 mRNA及SIRT1/p53通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示：各作用組SIRT1表達(dá)較空白對照組劑量依賴性逐漸降低(P<0.05)；p53表達(dá)較空白對照組升高(P<0.05)，但各作用組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖3)。

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與50 nmol/ml組相比，#P<0.05；與100 nmol/ml組相比，&P<0.05。

Western blotting檢測SIRT1、p53及Ac-p53蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，各作用組SIRT1蛋白表達(dá)劑量依賴性逐漸降低，Ac-p53蛋白表達(dá)劑量依賴性逐漸升高(P<0.05)；各作用組p53蛋白表達(dá)均較空白對照組升高(P<0.05)，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖4)。

3 討論

近年來，隨著對抗腫瘤藥物的不斷研究發(fā)現(xiàn)，中藥具有多靶點、多通路、多途徑、交叉發(fā)揮作用等特點，能夠作用于腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的多個環(huán)節(jié)，表現(xiàn)出獨特的抗腫瘤優(yōu)勢，受到醫(yī)學(xué)研究者的廣泛關(guān)注[9]。因此，找尋具有抗腫瘤作用的中藥不失為腫瘤研究的一種新途徑。雷公藤甲素是從雷公藤中提取的活性最高的成分之一，具有抗炎、抗生素、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及現(xiàn)代免疫學(xué)的進(jìn)步，雷公藤甲素的抗腫瘤活性被逐漸報道，指出其主要通過阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤新生血管形成等在人類

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與50 nmol/ml組相比，#P<0.05；與100 nmol/ml組相比，&P<0.05。

多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。近期研究證實，雷公藤甲素可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]；通過影響細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的磷酸化，顯著抑制肺癌A549細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬[12]；通過抑制P13K/AKT通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬[13]；通過降低HCA66表達(dá)，干擾核糖體18S RNA合成，誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯[14]。并證實，雷公藤甲素通過周期素依賴性激酶7/RNA聚合酶Ⅱ大亞基(cyclin dependent kinase 7/largest subunit of RNA polymerase Ⅱ, CDK7/RPB1)誘導(dǎo)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞殺傷[15]；雷公藤甲素通過激活腫瘤抑制基因p53抑制肝癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]；雷公藤甲素可誘導(dǎo)肺腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株A549/Taxol凋亡，抑制凋亡相關(guān)基因表達(dá)，通過抑制RNA聚合酶Ⅱ的功能及NF-κB信號通路抑制廣譜耐藥基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮耐藥逆轉(zhuǎn)作用[17]。以上研究提示，雷公藤甲素除發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用外還可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞多藥耐藥。本研究經(jīng)采用不同終濃度雷公藤甲素處理HepG2細(xì)胞，探究其對肝癌細(xì)胞增殖、遷移的作用，發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，呈時間-劑量依賴性，且顯著抑制了HepG2細(xì)胞遷移能力，提示雷公藤甲素有良好的抗腫瘤作用。

目前，已證實雷公藤甲素的抗腫瘤作用，但對其發(fā)揮作用的相關(guān)信號通路的研究報道各不相同。SIRT1/p53通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要途徑，SIRT1是組蛋白脫乙酰酶家族的成員，具有去乙酰化酶的作用，能夠調(diào)節(jié)p53、E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1，E2F1)、FOXO、NF-κB等非組蛋白產(chǎn)生去乙酰化，參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[18]。p53是細(xì)胞重要的轉(zhuǎn)錄因子及抑癌因子，研究證實，p53基因是SIRT1去乙酰化非組蛋白靶點，SIRT1激活可通過去乙酰化修飾p53蛋白，調(diào)控抑制p53基因表達(dá)，從而抑制p53蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。并證實，約90%的AC-p53可被SIRT1去乙酰化[5]。AC-p53作為p53的活化形式，可誘導(dǎo)不同位點基因表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。而基于SIRT1/p53信號通路，近年研究表明，miR-204通過靶向調(diào)控SIRT1/p53信號通路抑制霍奇金淋巴瘤細(xì)胞增殖[20]。雌二醇通過激活SIRT1/p53通路對人晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用[21]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)通過抑制SIRT1的酶活性，上調(diào)p53乙酰化水平，調(diào)控SIRT1/p53信號通路抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。半乳糖醇通過調(diào)控SIRT1/p53通路抑制肝細(xì)胞癌的增殖和遷移[23]。miR-34a通過調(diào)控SIRT1/p53通路能夠抑制人SW480細(xì)胞的遷移和侵襲[24]。此外，最新研究表明，SIRT1參與調(diào)節(jié)包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，肝細(xì)胞癌中SIRT1的去乙酰化酶活性是其致癌的關(guān)鍵[25]。肝癌患者大多存在p53的異常或突變，肝癌組織及細(xì)胞中SIRT1異常高表達(dá)，與臨床病理及預(yù)后關(guān)系密切，提示SIRT1、p53是肝癌治療研究的新型靶點。基于此，本研究探究了雷公藤甲素是否通過調(diào)控SIRT1/p53信號通路進(jìn)一步發(fā)揮抗腫瘤作用。研究初步驗證發(fā)現(xiàn)，相比空白對照組，各濃度作用組SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)劑量依賴性逐漸降低，Ac-p53蛋白表達(dá)劑量依賴性逐漸升高；p53 mRNA及蛋白表達(dá)較空白對照組明顯升高，但各濃度作用組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示雷公藤甲素預(yù)處理可以抑制SIRT1表達(dá)，促進(jìn)p53表達(dá)及乙酰化，可能通過調(diào)控SIRT1/p53信號通路進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖及遷移。

綜上所述，雷公藤甲素能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖及遷移，其可能通過降低SIRT1表達(dá)，上調(diào)Ac-p53表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控SIRT1/p53信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。