膳食膽酸對營養(yǎng)性肥胖大鼠腸道炎癥的改善及對腸道菌群中擬桿菌門與厚壁菌門比例的影響

陳 說， 張 帆， 范艷飛， 彭衛(wèi)群， 洪小瑜， 吳佩嫻

北京大學深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 深圳 518036

肥胖癥是一種由各種原因?qū)е轮窘M織在體內(nèi)過度蓄積的代謝障礙性疾病，一般以體質(zhì)量超過標準體質(zhì)量10%～15%為界定肥胖的標準[1]。肥胖癥病因分為內(nèi)源性、外源性兩種因素，前者包括遺傳、內(nèi)分泌失調(diào)等，后者為攝入過多高碳水化合物、高脂肪食物或運動不足[2]。此外，Macchione等[3]報道，腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡也可誘發(fā)肥胖癥。當前，許多研究[4-5]均指向通過藥物控制體質(zhì)量的研究方向，但實際上僅有小部分藥物被批準用于臨床，且其潛在不良反應(yīng)不可避免。膽酸是動物體內(nèi)膽固醇代謝時產(chǎn)生的固醇類物質(zhì)，由于其經(jīng)膽囊與膽汁一同排泄至腸道，且具有酸性，故稱為“膽酸”，多項報道[6-7]證明，其可促進糖類新陳代謝。現(xiàn)階段，膽酸不僅是膽固醇代謝副產(chǎn)品，在膳食脂類吸收與膽酸合成方面發(fā)揮重要作用，Sun等[8]報道，消融腸道微生物群可通過調(diào)節(jié)膽酸代謝來減輕肥胖所致脂肪肝和葡萄糖耐受不良等問題。但膽酸對肥胖人群的腸道炎癥及其對生物群結(jié)構(gòu)的作用及其機制的報道較少見，故本研究以膳食膽酸為實驗藥物，分析其對營養(yǎng)性肥胖大鼠模型腸道的影響及可能機制，為營養(yǎng)性肥胖治療研究新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性Wistar大鼠，60只，7周齡，體質(zhì)量260～270 g，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所[生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)K2019-0002]。實驗開展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動物實驗室溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，自然光照，自由攝食、飲水。本實驗全部操作符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器：膳食膽酸(純度99.8%，西華天生物科技有限公司)，芬氟拉明片(北京曙光藥業(yè)有限責任公司，國藥準字H11021033，規(guī)格20 mg)。甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，大鼠血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6) ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司)。兔抗大鼠G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(G-protein coupled bile acid receptor 1，GPBAR1/TGR5)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、GAPDH一抗(ABcam，貨號ab72608、ab145954、ab3486)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號ZB2306)。BS-800全自動生化分析儀(邁瑞醫(yī)療國際股份有限公司)，164-5070蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組和干預：取50只大鼠建造營養(yǎng)性肥胖大鼠模型[9]，予以高脂飼料(飼料組成：30%豬油、65%基礎(chǔ)飼料和5%蛋黃粉；主要營養(yǎng)成分：蛋白質(zhì)20%、碳水化合物30%和脂肪35%)喂養(yǎng)，每日一次性提供足夠飼料，自由飲水，喂養(yǎng)12周后稱重，若造模大鼠與健康大鼠體質(zhì)量差值/健康大鼠體質(zhì)量×100%>20%，表示造模成功。經(jīng)篩選獲得40只營養(yǎng)性肥胖大鼠，隨機分為模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組，每組各10只。剩余10只設(shè)為健康組，予以基礎(chǔ)飼料(基礎(chǔ)飼料組成：玉米280 g/kg、麩皮300 g/kg、豆餅200 g/kg、小麥110 g/kg、魚粉80 g/kg、骨粉20 g/kg、食鹽1 g/kg、多維素0.075 g/kg和植物油500 ml，主要營養(yǎng)成分：蛋白質(zhì)20%、碳水化合物35%和脂肪5%)喂養(yǎng)，1次/d。

造模成功后，陽性對照組灌胃4.16 mg/kg芬氟拉明(該劑量參考黃繼漢等[10]提出的“動物與人每公斤體質(zhì)量折算系數(shù)6.25”計算所得)，低劑量組、高劑量組分別灌胃50、100 mg/kg膳食膽酸(用0.5%羥甲基纖維素鈉溶解)[11]，模型組和健康組灌胃等體積0.5%羥甲基纖維素鈉，1次/d，連續(xù)干預17 d。

1.2.3 ELISA檢測血清炎癥因子和血清生化指標檢測：末次給藥后，麻醉大鼠，心臟采血，離心取上清，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ话胙鍢悠穮⒖糡NF-α、IL-6 ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度值，根據(jù)生存曲線計算各種大鼠血清TNF-α、IL-6水平。取剩余血清，用全自動生化分析儀檢測TG、TC、HDL-C和LDL-C水平。實驗均重復3次，取平均值。

1.2.4 高通量測序技術(shù)檢測腸道菌群結(jié)構(gòu)：取肛門到回盲腸部分結(jié)腸組織，取其內(nèi)含的新鮮糞便200 mg，加入70%乙醇1 ml，7 500 r/min離心5 min后棄上清，加PBS離心棄上清。將離心管置于吸水紙上，倒置無液體流出，在55 ℃烘箱內(nèi)放置10 min。用DNA提取試劑盒提取細菌總DNA，按試劑盒說明書進行擴增、純化。高通量測序上機操作，按照可操作分類單元分類物種，特定導出擬桿菌門、厚壁菌門樣品進行比較。實驗重復3次，取平均值。

1.2.5 HE染色觀察脂肪細胞大小：心臟采血處死大鼠，剖腹分離出腎和睪丸周圍脂肪，固定于10%多聚甲醛溶液，經(jīng)乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列操作后，制作4 μm厚的切片。脫蠟至水，進行HE染色，顯微鏡下觀察組織上脂肪細胞大小變化。

1.2.6 Western blotting檢測大鼠結(jié)腸中TGR5、NF-κB蛋白表達：取結(jié)腸組織清洗干凈后，在加入液氮的研缽內(nèi)剪碎，加RIPA裂解液提取蛋白，BCA檢測蛋白濃度，加上樣緩沖液，沸水浴變性，進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。加TGR5、NF-κB、GAPDH一抗(稀釋1∶1 000)過夜，次日加二抗(1∶2 000)孵育2 h。ECL曝光顯色，計算目標蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠增重率和肥胖指數(shù)與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠增重率和肥胖指數(shù)較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠增重率和肥胖指數(shù)較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠增重率和肥胖指數(shù)較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠增重率和肥胖指數(shù)較低(P<0.05)(見表1)。

2.2 大鼠血清炎癥因子水平與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組及陽性對照組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠血清TNF-α、IL-6水平較低(P<0.05)(見表2)。

表1 各組大鼠增重率和肥胖指數(shù)Tab 1 Weight gain rate and obesity index of rats in each

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平Tab 2 Serum TNF-α and IL-6 levels of rats in

2.3 大鼠血脂水平各組大鼠血清HDL-C水平組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較低(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平Tab 3 Serum TG, TC, HDL-C and LDL-C levels of rats in each group mol/L)

2.4 大鼠腸道菌群中擬桿菌門與厚壁菌門比例與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠腸道中擬桿菌門比例較低，厚壁菌門比例較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠擬桿菌門比例較高，厚壁菌門比例較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組大鼠擬桿菌門比例較高，厚壁菌門比例較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽性對照組大鼠擬桿菌門比例較高，厚壁菌門比例較低(P<0.05)(見表4)。

2.5 大鼠腎與睪丸周圍脂肪病理學健康組大鼠脂肪細胞體積較小，偏橢圓形。與健康組比較，模型組大鼠脂肪細胞形態(tài)飽滿，呈圓形，細胞壁模糊，細胞相交處可見有融合成大細胞團的趨勢；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組細胞呈多角形，細胞體塌陷，體積較小，細胞壁清晰(見圖1)。

表4 各組大鼠腸道菌群中擬桿菌門與厚壁菌門

注：A：健康組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組；E：陽性對照組。

2.6 大鼠結(jié)腸中TGR5、NF-κB蛋白表達與健康組比較，模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠結(jié)腸中TGR5蛋白相對表達量較低，NF-κB蛋白相對表達量較高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組結(jié)腸中TGR5蛋白相對表達量較高，NF-κB蛋白相對表達量較低(P<0.05)；與低劑量組比較，高劑量組和陽性對照組結(jié)腸中TGR5蛋白相對表達量較高，NF-κB蛋白相對表達量較低(P<0.05)；與高劑量組比較，陽性對照組結(jié)腸中TGR5蛋白相對表達量較高，NF-κB蛋白相對表達量較低(P<0.05)(見圖2、表5)。

注：A：健康組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組；E：陽性對照組。

表5 大鼠結(jié)腸中TGR5、NF-κB蛋白表達Tab 5 Expressions of TGR5 and NF-κB proteins

3 討論

隨著人們生活水平提高和飲食習慣變化，全球范圍內(nèi)肥胖群體快速壯大，肥胖不但影響人們外形美觀和正常生活活動，還與酒癮、艾滋病、毒藥麻痹并列為世界四大醫(yī)學社會問題，危害人類健康，亟需重視和解決。據(jù)Tilg等[12]報道，營養(yǎng)性肥胖患者因機體攝入營養(yǎng)物質(zhì)不均衡導致腸道微生態(tài)環(huán)境失調(diào)，宿主在能量獲取和脂肪堆積上出現(xiàn)變化，削弱腸道屏障功能，激發(fā)炎癥通路，誘發(fā)腸道炎癥問題。因此，抗炎是營養(yǎng)性肥胖治療過程中的必要環(huán)節(jié)。膽酸不但有抗病毒、抗寄生蟲和抗菌能力，還可加大脂肪在胰脂肪酶中的暴露面積，促進脂肪分解和消化，兼顧抗炎和減肥的雙重功效。故本研究建立了營養(yǎng)性肥胖大鼠模型，通過補充膳食膽酸方式觀察大鼠生理病理變化，為膳食膽酸療法的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

Jia等[13]認為，膽酸可用于治療脂肪肝，在解決營養(yǎng)性肥胖問題上有一定作用。本實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，低、高劑量組大鼠增重率、肥胖指數(shù)較低，HE染色顯示腎與睪丸周圍脂肪細胞較小，共同提示膽酸作為膳食添加劑使用時具備減肥作用，符合Jia等[13]的觀點。Desai等[14]提出的膽汁酸學說證實了胃腸道微生態(tài)對代謝疾病的調(diào)控作用。Zhao等[15]報道腸道菌群紊亂與肥胖有密切關(guān)系，推測可能是因腸道菌群紊亂影響腸道功能，其中對肥胖微生物攝取能力較強的腸道菌群占據(jù)優(yōu)勢，導致脂肪大量聚集誘發(fā)肥胖。腸道菌群紊亂不但影響脂肪存儲，還干擾血脂代謝功能，如腸道菌群中多糖消化酶、膽固醇氧化鎂等可降解膽固醇，降低血清TG和TC濃度。擬桿菌門與厚壁菌門同為腸道主要菌群之一，二者存在一種互相促進的共生關(guān)系，可共同促進宿主吸收或儲存能量，故消化道內(nèi)擬桿菌門與厚壁菌門對發(fā)酵多糖十分重要，二者比例也十分重要，擬桿菌門降低或者厚壁菌門增高均有助于促進肥胖。血脂、腸道菌群和肥胖密切相關(guān)，高脂飼料可減少大鼠腸道黏蛋白，降低菌群多樣性，削弱腸道屏障能力，導致厚壁菌門等致病菌的侵襲風險增加，擬桿菌門等腸道屏障修復菌減少。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，低、高劑量組大鼠血清TG、TC和LDL-C水平較低，擬桿菌門比例較高、厚壁菌門比例較低，提示膳食膽酸可調(diào)節(jié)大鼠血脂代謝，增加有益菌比例，減少致病菌比例，調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，增強腸道屏障能力。營養(yǎng)性肥胖大鼠因腸道菌群變化，腸道屏障修復菌比例降低，致病菌感染概率升高，誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為腸道炎癥。TNF-α為炎癥反應(yīng)中始動細胞因子，IL-6參與炎癥急性期反應(yīng)，二者均為促炎細胞因子，結(jié)果顯示：低、高劑量組血清TNF-α和IL-6水平均低于模型組，提示膳食膽酸可減輕大鼠腸道炎癥。

研究[16]發(fā)現(xiàn)，膽酸可作為一種信號分子激活不同信號轉(zhuǎn)導途徑，發(fā)揮控制肥胖的作用。G蛋白偶聯(lián)受體是細胞信號轉(zhuǎn)導時的重要調(diào)節(jié)器，調(diào)控機體生長、發(fā)育、繁殖等多方面，有報道證明其可通過調(diào)控DNA合成影響促有絲分裂信號，從而影響脂肪細胞凋亡[17]。TGR5為一種G蛋白偶聯(lián)受體，是膽酸受體家族的重要成員之一，可與膽酸結(jié)合，引起下游一系列生物學效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)機體能量平衡、新產(chǎn)代謝等。Chaudhari等[18]表明，TGR5激活參與了減肥過程。Xiao等[19]報道TGR5激活后可抑制NF-κB通路，發(fā)揮抗炎作用。NF-κB可被TNF-α、IL-6等刺激因子激活，從而調(diào)節(jié)多種促炎細胞因子轉(zhuǎn)錄，促進炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示：與模型組比較，低、高劑量組TGR5蛋白相對表達量較高、NF-κB蛋白相對表達量較低，提示膽酸可能通過激活TGR5蛋白、抑制NF-κB通路發(fā)揮作用。

綜上所述，膳食膽酸對營養(yǎng)性肥胖大鼠有減肥作用，可調(diào)節(jié)腸道內(nèi)擬桿菌門與厚壁菌門比例，發(fā)揮抗炎作用，可能是通過激活TGR5蛋白、抑制NF-κB通路實現(xiàn)的。