貴州凱里酸湯食用頻次對大鼠非酒精性脂肪性肝病的影響及機制研究

李正超， 叢 碩， 劉詠梅， 胡亞欣， 朱紫馨， 程明亮

1.貴州醫科大學臨床醫學院，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學附屬醫院感染科

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是全球最常見的慢性肝病之一，我國人群患病率為29.81%，其中2%～3%會發展為非酒精性脂肪性肝硬化，中東地區(32%)和南美洲(30%)的NAFLD患病率最高，非洲最低(13%)[1-2]。大數據顯示，NAFLD患病率仍處于持續上升階段，并且年輕化、大眾化趨勢日益顯著[3]。

凱里酸湯為貴州省非物質文化遺產，是一種少數民族傳統工藝發酵食品。由辣椒、番茄和糯米經二次發酵制作而成[4]。課題組前期調查研究發現，黔東南地區人群喜食凱里酸湯，其NAFLD的患病率(18.19%)明顯低于貴州省平均水平(23.92%)[5]和我國(29.81%)平均水平，且運動和酸湯飲食因素成為該地區NAFLD患病的保護性因素。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR)是一種新型甾體類激素受體，包括PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ三種亞型[6]。其中PPAR-α為一種核受體蛋白，可被脂肪酸及一些過氧化物酶增殖劑激活，參與調控免疫反應和脂質代謝[7]。固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)是調節與脂質代謝基因表達的關鍵核轉錄因子，SREBP-1c是肝臟脂質代謝的關鍵調控者，幾乎參與肝臟所有TG和脂肪酸合成基因的轉錄[8]。有研究[9]表明，PPAR-α的激活將抑制SREBP-1c途徑。

NAFLD至今仍無特效的治療藥物，目前改善的方法仍以生活方式的改變和飲食習慣的調整為主[10]。因此，本研究擬探討貴州凱里酸湯不同食用頻次對NAFLD大鼠的影響，并觀測PPAR-α/SREBP-1c在凱里酸湯干預非酒精性脂肪形成過程中的調控機制，旨在明確貴州凱里酸湯食用頻次對NAFLD的影響，為NAFLD的防治提供更加明確的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：32只7周齡SD雄性大鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001，所有動物實驗均經貴州醫科大學動物實驗倫理委員會批準(批號：1901001)，符合實驗室動物管理與使用準則。

1.1.2 試劑與儀器：凱里酸湯由貴州凱里亮歡寨餐飲娛樂有限公司提供。TLR4(76B357.1)、p-STAT1(ab109461)、Zo-1(ab190085)、Occludin-1(ab216327)、β-actin(ab8226)一抗購自Abcam公司。兔二抗體(PMK-014-102)購自普美生物。HE染色(C0105S)及油紅O(C0157S)染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(P0012S)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0690)購自碧云天生物有限公司。PCR試劑盒(BL698A)購自擎科生物有限公司。垂直電泳儀(WIX-miniPRO4)購自韋克斯生物有限公司。高速離心機(1-14K)購自成都格朗科技。實時熒光定量PCR儀(羅氏Light Cycler 480)購自北京龍躍生物科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NAFLD大鼠造模及酸湯干預：將32只SPF級7周齡雄性SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為4組:正常對照組(ND組，n=8)、高脂模型組(HF組，n=8)、高脂飲食+每天灌胃酸湯組(HS1組，n=8)、高脂飲食+隔天灌胃酸湯組(HS2組，n=8)。固定時間將酸湯煮沸后冷卻至室溫再行灌胃，每次灌胃劑量為1 ml/100 g，非干預組用等體積雙蒸水灌胃。各組大鼠均自由進食和飲水。

1.2.2 采集標本：每周三稱量大鼠體質量并記錄，觀察各組小鼠皮毛、色澤、精神面貌、飲食等情況。12周末，10%水合氯醛0.6 ml/100 g腹腔注射麻醉，剖開胸腹，心臟穿刺取全血，取肝臟、回腸組織。

1.2.3 生化及血清ELISA：將全血置于低速離心機4 000 r/min離心5 min，取上清，采用全自動生化分析儀檢測生化指標，并用ELISA試劑盒檢測血清IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.2.4 肝臟組織病理學：將肝臟組織用4%多聚甲醛溶液固定48 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制成石蠟切片，然后用HE染色試劑盒進行染色，中性樹膠封片固定，光學顯微鏡檢查并取圖。液氮中肝組織制成冰凍10 μm切片，根據油紅O試劑說明進行染色，蘇木素復染，熒光顯微鏡下觀察并取圖。

1.2.5 組織蛋白表達水平檢測：采用Western blotting法檢測組織中蛋白的表達水平，取0.04 g肝腸組織，裂解液裂解得到總蛋白，測得蛋白濃度，配制2 μg/ml蛋白濃度溶液，用SDS-PAGE凝膠進行蛋白電泳，并轉膜至PVDF膜上，封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育2 h，Bio-Rad凝膠成像系統成像。本實驗以β-actin作為內參。

1.2.6 qRT-PCR檢測基因PPAR-α及脂質代謝SREBP-1c mRNA的表達：取新鮮肝臟30 mg，利用RNA提取試劑盒提取總mRNA，逆轉錄成cDNA，隨后使用qRT-PCR擴增，使用2-ΔΔCT計算各組基因的mRNA相對表達量。引物序列如表1所示。qRT-PCR反應溶解曲線呈單峰為特異。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 酸湯干預對NAFLD大鼠肝臟損傷及血脂水平的影響血清生化檢測顯示，與ND組比較，HF、HS2組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；HS1組ALT、AST水平顯著升高，TC、TG、LDL-C、HDL-C水平差異無統計學意義(P>0.05)；與HF組比較，HS1組上述所有指標明顯改善(P<0.05)，HS2組TC、TG、LDL-C、HDL-C明顯改善，且HS1組比HS2組改善顯著(P<0.05)(見表2)。

表2 各組SD大鼠血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

2.2 酸湯干預對NAFLD大鼠血清炎性因子水平的影響ELISA檢測血清炎性因子水平顯示，與ND組比較，HF組、HS1組、HS2組IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與HF組比較，酸湯干預后HS1組IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，HS2組IL-6、IL-8顯著降低(P<0.05)，與HS2組比較，HS1組IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)(見表3)。

2.3 酸湯干預對NAFLD大鼠肝臟病理學的影響ND組大鼠肝臟肝小葉結構完整，分界明顯，肝細胞索排列整齊，形態清晰，肝細胞體積大，胞質豐富透明，胞核大而圓，居中，異染色質少而著色淺，無明顯紅色脂滴；HF組大鼠肝細胞形態不規則，胞質內大量脂肪空泡，肝細胞索排列紊亂，HS1組中肝細胞形態清晰，鏡下少量紅色脂滴沉積，肝細胞索排列整齊，HS2組脂滴較HF組少，肝細胞索排列仍紊亂，改善程度明顯低于HS1組(見圖1)。

表3 各組SD大鼠血清中炎癥因子水平對比

圖1 肝臟組織病理學 HE及油紅O染色(放大200倍)Fig 1 HE and oil red O staining of liver histopathology

2.4 酸湯干預對NAFLD大鼠肝組織TLR4、p-STAT1蛋白表達的影響與ND組比較，HF組、HS2組肝臟組織炎癥相關蛋白TLR4、p-STAT1表達量顯著升高(P<0.05)，HS1組上述蛋白表達變化不顯著，差異無統計學意義(P>0.05)；與HF組比較，HS1組上述蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，HS2組變化不顯著，差異無統計學意義(P>0.05)；與HS2組比較，HS1組顯著降低(P<0.05)(見圖2、表4)。

圖2 各組大鼠肝臟TLR4、p-STAT1蛋白表達Fig 2 Expressions of TLR4 and p-STAT1 in the liver of

2.5 酸湯干預對SD大鼠腸道的影響及腸壁通透性相關蛋白的表達HE染色顯示，ND組腸道絨毛整齊排列，結構完整。HF組絨毛部分出現斷裂、融合，腺體擴張，絨毛水腫，上皮細胞水腫，核增大。HS1組腸道絨毛排列整齊，無斷裂、融合、無水腫，結構完整。HS2絨毛斷裂較少，腺體擴張不明顯，介于HF組與HS1之間(見圖3)。

利用Western blotting檢測腸壁通透性蛋白Zo-1、Occludin-1蛋白。與ND組比較，HF、HS2組大鼠組織Occludin-1、Zo-1蛋白顯著降低(P<0.05)，HS1組上述指標變化不顯著，差異無統計學意義(P>0.05)；與HF組比較，HS1組Occludin-1、Zo-1蛋白顯著升高(P<0.05),HS2組Zo-1蛋白顯著升高(P<0.05)，且HS1組比HS2組顯著(P<0.05)(見圖4、表4)。

圖4 各組大鼠回腸Zo-1、Occludin-1蛋白表達Fig 4 Expressions of Zo-1 and Occludin-1 in the

2.6 酸湯干預對肝臟PPAR-α及脂質代謝SREBP-1c mRNA的表達脂質代謝相關基因據qRT-PCR結果顯示，與ND組比較，HF組肝臟組織SREBP-1c mRNA水平顯著升高(P<0.05)，PPAR-α mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與HF組比較，HS1、HS2組SREBP-1c mRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)，HS1組PPAR-α mRNA水平顯著升高(P<0.05)，且上述指標HS1組比HS2組顯著(P<0.05)，HS2組PPAR-α mRNA水平變化不顯著,差異無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

表4 qRT-PCR和Western blotting分析結果

3 討論

貴州凱里酸湯成分豐富，鄒大維[11]利用高效液相色譜對貴州凱里酸湯進行測定顯示，其中富含番茄紅素、辣椒堿、有機酸乳酸、乙酸、酒石酸、檸檬酸、礦物質Ca、P等。本實驗中采用煮熟貴州凱里酸湯，其豐富的營養成分在本研究中起著重要作用。

NAFLD的發生發展主要受脂質代謝、胰島素抵抗、遺傳等多因素影響，與肥胖、糖尿病等多種代謝綜合征密切相關，當機體出現胰島素抵抗、脂質代謝紊亂時，易導致代謝綜合征，脂肪、碳水化合物等物質發生代謝紊亂，脂質在局部組織部位過度浸潤，過多地沉積在肝細胞內，脂質物質代謝障礙造成脂肪微滴堆積在肝細胞內，逐步累積進而形成脂肪肝，導致不同程度的肝變性、壞死及炎性反應[12]。本研究中使用高脂飲食誘導SD大鼠構建NAFLD模型，與ND組比較，HF組ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，且肝臟組織炎性病變及大量脂滴沉積，提示造模成功。酸湯干預后，上述生化指標明顯改善，且HS1較HS2顯著，肝臟組織炎性病變減輕，脂質沉積減少，但HS1、HS2組與ND組比較，上述部分指標差異仍顯著，表明酸湯干預并未使NAFLD大鼠恢復至健康水平。證明了貴州凱里酸湯具有改善高脂飲食誘導的NAFLD模型，且每天酸湯干預效果更顯著，但并未使之恢復至健康水平。

IL-6可由單核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞等多種細胞分泌并進入肝臟，促進肝臟三酰甘油分泌，并抑制脂蛋白酯酶，阻止脂質分解，進而加劇脂質代謝紊亂[13]。TNF-α是脂蛋白酯酶抑制劑，可減少外周脂肪組織分解，促進TG的合成和聚集，加重脂質的沉積[14]。IL-8促進炎癥細胞如中性粒細胞聚集至肝臟引起炎癥，脂質沉積在肝細胞中也可刺激Kupffer細胞釋放TNF-α，并促進IL-8的產生，并參與肝臟炎癥反應，導致肝臟損傷[15]。當肝臟代謝紊亂時，聚積的脂質刺激巨噬細胞分泌炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α，這些炎性因子是參與炎癥反應相關的重要介質，激活炎癥級聯反應，引起機體炎癥反應和組織損傷[16]。本研究顯示，貴州凱里酸湯顯著改善肝臟代謝紊亂，降低脂質沉積，降低血清炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平。且HS1組較HS2組效果顯著。但HS1、HS2組與ND組比較，上述指標差異仍顯著，表明酸湯干預并未使NAFLD大鼠恢復至健康水平。證明貴州凱里酸湯可降低血清中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α水平，且每天酸湯干預效果更顯著。

“腸-肝軸”理論將腸道與肝臟緊密聯系[17]。二者通過門靜脈緊密聯系，腸道血液經門靜脈回流入肝臟，肝臟產生并分泌膽汁排入小腸。機體正常情況下腸黏膜屏障由機械屏障、化學屏障、免疫屏障與生物屏障共同構成，其中以機械屏障最為重要，由完整的腸黏膜上皮細胞及上皮細胞間的緊密連接相關蛋白Zo-1、Occludin-1等形成[18]。NAFLD大鼠肝臟脂質大量沉積，可激活TLR4通路，造成各種炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α分泌增加，肝臟分泌的各種炎性因子通過腸-肝循環進入腸道，引起腸道炎癥級聯反應，造成腸黏膜屏障破壞，同時腸道內毒素通過腸黏膜入血，經門靜脈到達肝臟，進一步激活TLR4通路，形成惡性循環[19]。本研究中，酸湯干預后，腸絨毛斷裂、融合明顯減少，腺體擴張、絨毛水腫、上皮細胞水腫程度明顯改善，HS1組腸壁通透性相關蛋白表達顯著改善，HS2組未見明顯改善。證明了貴州凱里酸湯可緩解NAFLD引起的腸黏膜屏障破壞，且每天酸湯干預效果更顯著。

TLR4是一種細胞表面TLRs，在肝星狀細胞膜上表達，與炎癥刺激的穩態失衡相關[20]。PPARs屬于類固醇/甲狀腺劑/維甲酸受體超家族，可調控許多維持能量平衡的代謝過程，包括脂肪細胞分化、炎癥、脂蛋白代謝和脂肪酸氧化，PPAR-α是一種核蛋白受體，參與NAFLD脂質代謝及炎癥反應過程，PPAR-α通過激活線粒體和調節過氧化物酶體脂肪酸氧化途徑在脂質轉運和代謝調節中起著至關重要的作用[21]。PPAR-α通過LXR途徑調節SREBP-1c的轉錄水平，調控乙酰輔酶A羧化酶和脂肪酸合成酶活性，促進脂肪酸的分解代謝[22-24]。當PPAR-α被抑制表達時，脂肪酸代謝障礙，肝臟大量脂肪沉積，代謝紊亂，導致活性氧形成、內質網應激、肝細胞損傷，導致脂毒性炎癥產生，脂毒性激活TLR4/p-STAT1途徑，引起炎癥反應，同時通過腸-肝循環，肝臟炎性因子進入腸道，導致腸道炎癥，腸壁通透性增大。本研究顯示,酸湯干預組PPAR-α上調，使SREBP-1c mRNA的表達水平降低,改善脂質代謝紊亂導致的炎性反應，降低了肝臟TLR4、p-STAT1的表達，并降低了血清中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α的水平，具有改善炎癥反應的功效，并改善腸壁通透性，且HS1組比HS2組顯著。

綜上所述，貴州凱里酸湯改善NAFLD的機制可能是通過上調PPAR-α/SREBP-1c改善NAFLD脂質代謝，緩解因脂質代謝紊亂導致的炎癥反應。且改善效果與食用頻次呈正相關。但本實驗并未對貴州凱里酸湯進行有效成分提取與驗證，亟需進一步研究。