宏基因組二代測(cè)序在伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累兒童噬血細(xì)胞綜合征中的應(yīng)用價(jià)值

張海洋 唐茂婷 卿露 李德淵 喬莉娜

（四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒童重癥醫(yī)學(xué)科/出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）為皰疹病毒科γ亞科，是一種嗜人類(lèi)淋巴細(xì)胞的皰疹病毒，在正常人群中感染非常普遍，90%以上的成人血清EBV抗體呈陽(yáng)性。原發(fā)性EBV感染典型表現(xiàn)為傳染性單核細(xì)胞增多癥（infectious mononucleosis，IM），在嬰幼兒中也可為無(wú)癥狀或其他不典型臨床表現(xiàn)。噬血細(xì)胞綜合征（hemophagocytic syndrome，HPS）是一類(lèi)兒童高發(fā)的系統(tǒng)性高炎癥反應(yīng)綜合征，臨床特點(diǎn)為細(xì)胞因子風(fēng)暴引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的臟器損傷，其起病急，進(jìn)展迅速，嚴(yán)重者未經(jīng)及時(shí)治療可發(fā)展為多器官功能衰竭，危及生命。感染可引起原發(fā)性或繼發(fā)性HPS，致病微生物以EBV最多見(jiàn)，EBV感染的不同狀態(tài)均可引發(fā)HPS［1］。HPS易合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)危急癥狀，常為暴發(fā)性疾病，預(yù)后極差［2］。既往經(jīng)驗(yàn)可以印證HPS產(chǎn)生的炎癥風(fēng)暴可使顱內(nèi)受累，但顱內(nèi)病理生理狀況未知，無(wú)法區(qū)分免疫風(fēng)暴或EBV感染引起的病毒性腦炎。疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病例應(yīng)盡早進(jìn)行腦脊液檢查以明確診斷，而目前兒童EBV相關(guān)HPS的治療指南均未提及對(duì)顱內(nèi)EBV感染的檢測(cè)［3-4］，傳統(tǒng)EBV檢測(cè)手段存在諸多局限性［5-7］，且聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)腦脊液EBV-DNA的靈敏度尚未有確切的臨床數(shù)據(jù)。

宏基因組二代測(cè)序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）技術(shù)是基于基因組學(xué)的病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)［8-9］，其無(wú)需培養(yǎng)、無(wú)需預(yù)判，且效率高，大部分檢測(cè)機(jī)構(gòu)能在24 h內(nèi)出具報(bào)告，能精準(zhǔn)識(shí)別感染的病原體，已廣泛在危重、復(fù)雜的腦炎、腦膜炎的診斷中應(yīng)用［10-12］。在過(guò)去的二十年里，盡管病原體特異性檢測(cè)（如PCR病毒核酸檢測(cè)和特異性抗體檢測(cè)）取得了一定進(jìn)展，但腦炎患者的診斷率仍然很低［13］。本研究采用mNGS檢測(cè)有中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累癥狀的HPS患兒的腦脊液，尋找此類(lèi)患兒顱內(nèi)EBV感染的依據(jù)，以明確EBV相關(guān)HPS是否容易誘發(fā)EBV感染引起的病毒性腦炎。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2020年1月—2022年4月我院兒童重癥監(jiān)護(hù)室（pediatric intensive care unit，PICU）收治的EBV相關(guān)HPS患兒30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2004年HPS診斷標(biāo)準(zhǔn)（HLH-2004）及《噬血細(xì)胞綜合征診治中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1，3-4］；（2）血 清EBV-DNA>400拷 貝/mL；（3）伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；（4）腦脊液mNGS檢出EBV。排除標(biāo)準(zhǔn)：資料不完善或失訪者，無(wú)明確臨床診斷者。所有患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意，本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（醫(yī)學(xué)科研-2021-申181）。

1.2 生化檢測(cè)

腦脊液的采集：入院72 h內(nèi)通過(guò)腰椎穿刺術(shù)抽取腦脊液約5 mL，存放于低吸附無(wú)菌采樣管，采樣過(guò)程嚴(yán)格控制無(wú)菌，采集后立即送檢mNGS和PCR檢測(cè)。

血清學(xué)檢測(cè)：采集初次擬診為伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累患兒的外周靜脈血，分別行血常規(guī)、肝腎功能、鐵蛋白、凝血功能、血脂、腦脊液EBVDNA定性檢測(cè)、血清EBV-DNA定量檢測(cè)及血清EBV抗體譜檢測(cè)。血清EBV-DNA≥1×103拷貝/mL可視為異常［14］。

腦脊液PCR檢測(cè)：取200 μL腦脊液樣本提取DNA，采用實(shí)時(shí)熒光PCR分析（熒光定量Q5，賽默飛，美國(guó)），對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)（腦脊液PCR操作及質(zhì)控須符合院內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范的要求）。

1.3 mNGS方法

DNA提取與質(zhì)控：取200 μL腦脊液樣本于室溫下5 000 r/min離心10 min取上清液，使用天根核酸提取試劑盒（DP316，北京天根生化科技有限公司）提取上清液中的DNA并完成純化，每批樣本檢測(cè)設(shè)置不添加任何微生物的陰性對(duì)照，以及加入混合菌的陽(yáng)性對(duì)照，用Qubit 2.0（Thermo Fisher，美國(guó)）和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA含量，進(jìn)行質(zhì)控。參照DNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（Illumina）操作手冊(cè)，在待測(cè)DNA片段兩頭加上能與測(cè)序儀器識(shí)別的已知序列片段，進(jìn)行擴(kuò)增與富集，采用Agilent 2100 Bioanalyzer（安捷倫，美國(guó)）完成文庫(kù)質(zhì)控。在Illumina二代測(cè)序平臺(tái)Nextseq 550Dx上進(jìn)行75 bp單端高通量測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)

使用Fastp軟件去除原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量、重復(fù)、冗余片段及接頭序列，獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，通過(guò)Bowtie2比對(duì)人源參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)去除人源宿主序列，未比對(duì)上的數(shù)據(jù)與自建微生物（包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒和寄生蟲(chóng)）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。

mNGS檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：一般情況下認(rèn)為正常人腦脊液是絕對(duì)無(wú)菌的，檢測(cè)到微生物即考慮為病原體檢出，將檢出序列數(shù)≥3定為結(jié)果陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析與圖形繪制。計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)，采用多元線性回歸方法分析影響腦脊液mNGS EBV檢出序列數(shù)的臨床指標(biāo)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 30例患兒的臨床資料

30例患兒中位年齡為3.0（0.7，6.5）歲，骨髓涂片均有噬血現(xiàn)象，其中2例有家族性噬血基因。患兒均表現(xiàn)出煩躁不安、抽搐、嗜睡等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，合并腦脊液白細(xì)胞及蛋白水平正常或輕度增高，腦脊液mNGS EBV檢出序列數(shù)均大于3，均診斷為病毒性腦炎［15-16］。其他臨床資料見(jiàn)表1。

表1 30例伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的HPS患兒的臨床資料

2.2 30例患兒血清EBV抗體譜結(jié)果

30例患兒VCA-IgG、EBNA-IgG均為陽(yáng)性，其中2例（7%）VCA-IgM陰性，提示既往感染，為檢測(cè)陰性結(jié)果；28例（93%）VCA-IgM陽(yáng)性，提示原發(fā)感染晚期或再激活，為檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果。3例（10%）患兒VCA-IgG為低親合力抗體，提示原發(fā)性急性感染［17］；3例（10%）VCA-IgA陽(yáng)性，是近期感染、感染再激活或慢性反復(fù)持續(xù)性感染標(biāo)志［18］。

2.3 腦脊液mNGS EBV檢測(cè)結(jié)果

mNGS檢出EBV序列數(shù)最高為28 880，最低為43，中位檢出序列數(shù)為2 400（420，1.3×104）。檢出序列數(shù)40~1×103有10例，1.1×103~1×104有11例，超過(guò)1×104有9例。

2.4 腦脊液mNGS與EBV傳統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果比較

腦脊液mNGS EBV檢測(cè)陽(yáng)性率為100%（30/30），腦脊液EBV-DNA定性檢測(cè)陽(yáng)性率為10%（3/30），血清EBV抗體譜檢測(cè)陽(yáng)性率為93%（28/30）。腦脊液mNGS EBV檢測(cè)陽(yáng)性率高于腦脊液EBV-DNA定 性 檢 測(cè) 陽(yáng) 性 率（χ2=49.091，P<0.001），而腦脊液mNGS EBV檢測(cè)陽(yáng)性率與血清EBV抗體譜陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.517，P=0.469）。

將mNGS EBV檢出序列數(shù)與患兒年齡、血清鐵蛋白、腦脊液蛋白、腦脊液白細(xì)胞數(shù)、治療前血清EBV-DNA拷貝數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)治療前血清EBV-DNA拷貝數(shù)與EBV檢出序列數(shù)呈中度正相關(guān)（rs=0.693，P<0.001），見(jiàn)表2。

表2 EBV檢出序列數(shù)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

將以上數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸分析，徳賓·沃森值為2.602，共線性方差擴(kuò)大因子均小于2.5，說(shuō)明以上參數(shù)相互之間獨(dú)立。結(jié)果顯示，治療前血清EBV-DNA拷貝數(shù)越高，腦脊液mNGS EBV檢出序列數(shù)越高（P=0.017）。見(jiàn)表3。

表3 多元線性回歸分析結(jié)果

2.5 治療前后血清EBV-DNA拷貝數(shù)變化

根據(jù)mNGS結(jié)果，患兒接受阿昔洛韋［10 mg/kg，8 h 1次］抗病毒與地塞米松或甲潑尼龍+足葉乙甙治療。治療前血清EBV-DNA拷貝數(shù)中位數(shù)為28 050（7 808，1.04×105），針對(duì)性治療后患兒血清EBV-DNA拷貝數(shù)均下降，中位數(shù)為875.0（436.0，1892.5），僅2例 患 兒 治 療 后EBV-DNA拷貝數(shù)仍超過(guò)6.0×104，該2例患兒治療結(jié)局均為死亡。

3 討論

本研究采用mNGS檢測(cè)30例伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的HPS患兒腦脊液，提供HPS患兒顱內(nèi)EBV感染證據(jù)。病毒的分離與鑒定是病毒病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但病毒寄生于活細(xì)胞中，分離鑒定困難，并且耗時(shí)長(zhǎng)。EBV是導(dǎo)致亞洲幼兒HPS的重要因素，HPS病情暴發(fā)迅速，進(jìn)展快，嚴(yán)重影響初發(fā)或復(fù)發(fā)患兒預(yù)后。早期診斷、提前干預(yù)對(duì)降低患兒病死率至關(guān)重要，但關(guān)于HPS顱內(nèi)EBV感染的研究未見(jiàn)報(bào)道。

mNGS作為在兒童危急重癥中應(yīng)用時(shí)間尚短的一門(mén)檢測(cè)技術(shù)，相比血清EBV-DNA拷貝數(shù)更能發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)受累證據(jù)，極大地避免了漏診、誤診，降低患兒病死率的同時(shí)提高生存質(zhì)量。關(guān)于抗病毒療程的制定，或?qū)⒉灰蕾囇錏BV-DNA拷貝數(shù)下降指數(shù)判定，其陡然下降并非能代表體內(nèi)全部EBV的有效清除，也需參考腦脊液mNGS EBV檢出序列數(shù)情況。腦脊液是一種絕對(duì)無(wú)菌的體液，腦脊液中病原體載量低，PCR擴(kuò)增具有偏向性［19-20］，故腦脊液PCR檢測(cè)可能引起漏檢，mNGS能更精確地發(fā)現(xiàn)HPS患兒顱內(nèi)EBV感染的證據(jù)，為早期干預(yù)、制訂更加完善的抗病毒治療方案提供借鑒。

本研究也存在一些局限性，首先，病例數(shù)量偏少，患兒年齡差距較大，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)未排除因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)帶來(lái)的一些偏差；其次，單中心檢測(cè)結(jié)果有待于多中心研究結(jié)果驗(yàn)證，闡明顱內(nèi)EBV感染對(duì)兒童HPS產(chǎn)生、發(fā)展的影響；最后，患兒好轉(zhuǎn)后未進(jìn)行腦脊液mNGS復(fù)測(cè)，后續(xù)隨訪數(shù)據(jù)有待于繼續(xù)研究。

綜上，本研究通過(guò)mNGS發(fā)現(xiàn)EBV在HPS患兒引起顱內(nèi)感染的證據(jù)，并以血清EBV抗體譜、治療前后血清EBV-DNA拷貝數(shù)作為參照，證明EBV相關(guān)HPS容易誘發(fā)EBV感染引起的病毒性腦炎，但有待于多中心更大數(shù)據(jù)研究驗(yàn)證。

志謝：感謝迪飛醫(yī)學(xué)科技（南京）有限公司對(duì)本研究的支持。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。