動物疫病監(jiān)測樣品采集操作要點及注意事項

江美蓮

（池州市動物疫病預防與控制中心 247100）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和科技的進步，近年來動物疫病實驗室檢測能力進一步提升，動物疫病監(jiān)測工作在高致病性禽流感、非洲豬瘟等重大動物疫病防控工作中所起到的作用愈發(fā)明顯。基層動物疫病預防控制機構(gòu)通過疫病監(jiān)測工作的開展，能及時掌握轄區(qū)內(nèi)畜禽某種病原感染和分布情況，發(fā)現(xiàn)疫病傳播的風險因素，評估畜禽群體免疫效果，有效控制相應動物疫病的發(fā)生與發(fā)展。而樣品采集工作是動物疫病監(jiān)測中至關重要的環(huán)節(jié),是實驗室檢測工作的基礎，最終影響監(jiān)測結(jié)果的可信度以及能否反映出當?shù)貏游镆卟〉恼鎸嵡闆r。因此，采樣人員務必要掌握正確的樣品采集方法，規(guī)范使用采樣器具，明確采樣注意事項，安全保存和運輸，確保待檢樣品的有效性。

1 樣品種類

動物疫病監(jiān)測常用樣品主要可歸納為血液、組織和拭子三大類。其中血液樣品又分為全血抗凝血、抗凝血漿和非抗凝血析出的血清；組織樣品有實質(zhì)器官、淋巴結(jié)、扁桃體以及皮膚等；拭子樣品主要有沾取呼吸道分泌液的口腔/喉氣管棉拭子、獲取糞便的泄殖腔（肛）棉拭子、病患部水泡液拭子以及環(huán)境棉拭子等。不同種類的樣品采集時操作技術要點也有所差別。

2 采樣原則

采樣人員在采集樣品時，需要遵循以下原則：一是采集的樣品必須具有足夠的代表性；二是要根據(jù)檢測項目和內(nèi)容來選擇相應的采樣時間；三是采樣過程中要嚴防造成環(huán)境污染和疫病傳播擴散。天然孔流血、血凝不良的病死動物，首先應采取耳尖血涂片，排除炭疽，要做好個人防護，做好環(huán)境消毒和廢棄物處理，嚴防病原擴散。

2.1 保障樣品的代表性

采集樣品必須要考慮樣品是否具有代表性，充分展示目標群體特性，抽樣調(diào)查是借助于抽樣數(shù)據(jù)來分析總體情況。在實際采樣的過程中，采樣人員要充分考慮待監(jiān)測區(qū)的布局、動物種類、數(shù)量、遷徙習慣、流通情況等因素，通過建立代表監(jiān)測點，來了解總體情況，根據(jù)疫病流行規(guī)律、監(jiān)測目標、采樣方法等進行采集。隨著實驗室檢測檢驗技術的不斷改進和發(fā)展，技術創(chuàng)新層出不窮，采樣人員在樣品采集之前，要充分了解檢驗相關要求，有針對性地采集相應樣品。

2.2 保證樣品的時效性

采樣前，必須考慮采樣的目的，根據(jù)需要檢測的項目和內(nèi)容，選擇最恰當?shù)臅r機進行樣品采集。例如，目前動物疫病監(jiān)測實驗室主要是抗體檢測和病原檢測，這兩種物質(zhì)會隨時間產(chǎn)生變化。在注射疫苗或感染病原后，機體內(nèi)不同時期抗體或病原濃度有較大差距，進而導致監(jiān)測數(shù)值出現(xiàn)變化。死亡的動物尸體腐敗速度受外界環(huán)境如溫度等因素影響較大，病料采集時間要求較嚴。動物機體狀況瞬息萬變，檢測結(jié)果僅代表樣品采集當時動物的身體情況，因此要注意監(jiān)測結(jié)果的修復和整理，提升疫病監(jiān)測的準確度。

3 動物疫病監(jiān)測采樣技術要點

3.1 器械工具

包括采樣箱、保溫箱或者保溫瓶、一次性注射器（針頭）、解剖刀、剪刀、鑷子、酒精燈、酒精棉、碘酒棉、棉簽、玻片、無菌棉拭子、試管架、冰袋等采樣用品；離心管、平皿、塑料瓶、樣品自封袋、塑料包裝袋等樣品容器；記號筆、簽字筆、標簽、封條、膠布、采樣單等采樣記錄用品；以及根據(jù)需要可能用到的阿氏液、PBS 液、30%甘油鹽水緩沖液、肉湯和雙抗等保存液；此外，還需配備口罩、防護鏡、一次性手套、乳膠手套、防護服、膠靴等人員防護用具。

3.2 血液樣品采集

3.2.1 采集部位

基層實際工作中常見動物采血部位：禽類進行常規(guī)免疫抗體監(jiān)測時，通常選擇翅下靜脈；小豬采血一般選擇前腔靜脈，大豬或成年母豬較難保定，前腔靜脈采集對采樣人員技術嫻熟性要求較高，可使用一次性真空采血管采集耳靜脈血；牛、羊通常選擇頸靜脈。

3.2.2 全血（抗凝血）樣品

使用一次性注射器抽取合適位置的靜脈血，血液采集完成后及時加入抗凝劑，充分混合，防止血液出現(xiàn)凝固現(xiàn)象；或者使用一次性帶管針頭插入靜脈后，直接連接負壓醫(yī)用抗凝管收集。輕柔緩慢旋轉(zhuǎn)晃動，將收集的抗凝血混合均勻，靜置一段時間，可得上清血漿。

3.2.3 血清（非抗凝血）樣品

不添加任何抗凝劑，使用一次性注射器直接采集血液樣品2～5mL，夏天室溫下傾斜靜置30～50min，冬天室溫下傾斜靜置2～4h，也可37℃下靜置40～50min，血液凝固后析出上清血清，3000r/min 離心5min 左右，將血清移入塑料離心管中，4℃保存待用。但若需保存較長時間，則要凍結(jié)保存于-20℃左右的環(huán)境中。

3.3 組織樣品采集

3.3.1 皮膚樣品

采集皮膚樣品一般選擇病變最典型處連同周邊健康部分一起。例如，進行口蹄疫病毒檢測時，可選取新鮮的結(jié)痂或水泡皮，使用清水對采集部位進行沖洗，剪取3～5g 的份量采集完整的結(jié)痂和完整水泡，或者用無菌注射器吸取不少于1mL 的水泡液，將樣品放進事先加入50%甘油或者磷酸鹽緩沖液的滅菌瓶中，蓋上蓋子密封瓶口。同種同群動物一般采集3～5 頭病畜，樣品采集完成后要及時進行冷凍保存。

3.3.2 實質(zhì)器官

采樣前對解剖刀具等進行徹底消毒，采樣過程中如果器械工具被污染，要使用酒精燈進行火焰消毒。按照由上到下、從外到內(nèi)、胸腔到腹腔的順序?qū)⑿枰臉悠芬来尾杉瑯悠贩胖糜谝淮涡运芰蠝缇蜃苑獯校芊獯冢糜浱柟P對動物種類、組織名稱、采樣日期、編號等內(nèi)容進行標注，每一個樣品單獨放置，避免交叉感染。

3.3.3 牛、羊腦

使用消毒后的剪刀從病死牛（羊）枕骨大孔處將腦硬膜剪開，向枕骨大孔中伸入食指，順時針旋轉(zhuǎn)一圈，將腦髓與腔壁相連的神經(jīng)、血管等有效切斷，進而能順利地挖出腦髓。然后抽出食指，貼著枕骨大孔腔壁將采樣勺插進去，按照大約牛腦5～7cm、羊腦4cm 的標準控制插入深度，抽回采樣勺，將腦組織往外挖出，即可完整取出延腦。

3.4 拭子樣品采集

3.4.1 禽口腔/泄殖腔拭子

對禽類進行高致病性禽流感等病原檢測時一般采集口腔（喉氣管）和泄殖腔拭子樣品。具體操作是一手固定禽頭頸，使其口腔張開，一手持經(jīng)過消毒滅菌的棉拭子從禽口腔向咽的后部插入，擦拭、旋轉(zhuǎn)后取出，放置于加入緩沖液的離心管中；一手提起尾羽，一手拿著棉拭子插入泄殖腔內(nèi)，深度約在1～5cm 之間，輕輕旋轉(zhuǎn)后抽出，將沾有泄殖腔黏膜表層的糞便、組織的棉拭子放入含有約2mL PBS 液的離心管中。折斷棉棒，蓋上離心管蓋子，確定密封好無滲漏，做好標記，保存于低溫環(huán)境中。

3.4.2 牛羊O/P 液

口蹄疫病原檢測經(jīng)常采集此樣品。采樣前，將探杯浸泡在1%氫氧化鈉溶液或0.2%檸檬酸溶液中3～5min，然后用與待采樣動物體溫接近的清水沖洗探杯。對動物進行保定處理，在動物吞咽時向食道5～10 cm 處插入探杯，來回抽動2～3 次后拉出探杯，即可采集到5～10mL 的O/P 液[1]。將采集到的O/P 液倒入含有磷酸緩沖液或者等量細胞培養(yǎng)液的滅菌瓶中，搖晃均勻后封口保存。每采集完成一頭動物，均要徹底消毒、沖洗探杯，避免動物交叉感染以及食道灼傷。

3.4.3 環(huán)境拭子

用生理鹽水浸濕無菌棉拭子后，在環(huán)境（物品）表面按“Z”字形軌跡畫線，邊畫邊旋轉(zhuǎn)棉拭子接觸面，連續(xù)數(shù)次，畫線區(qū)域盡可能覆蓋環(huán)境（物品）界面，面積越大，采集到病原的機會越大，采集完成后將棉頭放入潔凈的1.5mL 離心管中，加入保存液，折斷棉簽桿，蓋緊蓋子，做好標記。通常一個離心管中放2 個棉拭子。

4 樣品采集過程中常見問題

4.1 樣品的真實性存疑

由于對動物疫病監(jiān)測工作的意義和作用認識不夠，部分基層畜牧獸醫(yī)工作者遇到例如養(yǎng)殖場（戶）不配合，擔心畜禽產(chǎn)生應激反應，不利于生長等困難；或者采樣技術不嫻熟，難以順利采集足夠的樣品等情況時，為了完成采樣任務數(shù)量，可能會出現(xiàn)將一個樣品分成好幾份的情況，那么樣品的代表性和真實性就出現(xiàn)了偏差。

4.2 血液樣品的質(zhì)量不過關

實際采樣工作中，血清樣品會因為采血量過少，分離出的血清量達不到檢測需求，或者反復凍融等原因造成質(zhì)量下降。血液樣品時常會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，其產(chǎn)生原因可能有以下幾種，一是采血技術不熟練，針尖在血管中反復進出造成血腫，在血腫的地方抽取血液；二是排血到容器中速度過快致使紅細胞破裂；三是采血的注射器或容器受到了污染；四是采血之后沒有對樣品進行適當溫度保存或者沒有及時送到實驗室處理；五是血樣容器放置不穩(wěn)傾倒了或者在送樣的過程中受到了震蕩[2]。

4.3 組織樣品采集不規(guī)范

對病料組織進行樣品采集時，沒有選擇特定部位，采集的樣品沒有代表性；動物死亡后間隔了太長時間才進行采樣，采集到的組織樣品已腐敗變質(zhì)，被其他物質(zhì)或病原等污染；不按規(guī)定量采集病理組織，樣品體積太大或過小；采集同一動物體的不同組織樣品時，將所有病料混在一起，沒有獨立封裝、存放。

4.4 其他問題

沒有進行必要的采樣前準備工作，樣品采集所需器具、防護用品等有遺漏，或者未攜帶采樣登記表；棉拭子樣品采集過程中，沒有在塑料離心管中加入保存液；離心管的蓋子沒有蓋（擰）緊，液體滲漏出來，造成交叉污染；樣品編號不規(guī)范，采樣登記表記錄不詳細，例如畜禽日齡、免疫情況等信息填寫不全，后期難以追溯。

5 動物疫病監(jiān)測采樣注意事項

5.1 采樣全程需無菌操作

樣品采集所用到的器械、工具等均要求無菌，用于儲存樣品的容器必須保證完好無損，并且密封性好，采集過程滿足無菌操作要求。采樣人員務必注意做好個人防護，穿防護服，佩戴口罩、手套、鞋套，防止操作過程中接觸病原，造成生物學安全事故。需要剖解后采集內(nèi)臟器官等組織樣品時，遵循從胸腔到腹腔的順序進行，先采用無菌的方式采集動物的實質(zhì)器官，避免受到外界的污染，后采集胃腸和糞便等可能受到污染的組織[3]。

5.2 樣品的數(shù)量和質(zhì)量要符合要求

要結(jié)合監(jiān)測目標、監(jiān)測方案及實驗室的檢測能力等多種因素，根據(jù)相關標準采集適當?shù)臉悠窋?shù)量，提升有效性、滿足檢測需求的同時，還要留出備用量，防止做必要的重復檢測時分量不足。

為保證血液樣品質(zhì)量，采樣時需注意：如果使用的是一次性真空管，采血過程中血液應不間斷地流入管中，一旦血流間斷，則要另換管，否則不易析出血清；使用一次性注射器采血結(jié)束后，如果血液暫存注射器內(nèi)，要將活塞緩慢拉出液面一段距離，中間留有一段空氣；如果將血液從注射器移入試管，要沿著試管壁緩慢徐徐注入，不能有氣泡，也不能震蕩，傾斜靜置。

5.3 注意樣品種類和時效

要根據(jù)檢測目標有針對性地選擇相應時間段來進行樣品采集。①病原監(jiān)測。要根據(jù)不同種類病原特性、發(fā)病動物臨床癥狀、是否進行過治療以及曾經(jīng)有無發(fā)病史等情況綜合考慮，選擇相應的時間和部位進行樣品采集。活體動物一般采集其血液、乳汁、口鼻及生殖道分泌物等；死亡動物，采樣需越快越好，特別是氣溫較高的夏天，其內(nèi)臟病料不能超過6h，氣溫較低的冬天也不要超過24h，時間耽擱得越長，越容易產(chǎn)生不合格樣品。②抗體監(jiān)測。根據(jù)不同疫苗注射后在機體產(chǎn)生抗體的濃度選擇適當?shù)牟蓸訒r間。例如，禽流感、口蹄疫一般選擇在免疫21d后進行；豬藍耳病則選擇在免疫28d 后再進行[4]。需要注意的是采血之前最好讓待采動物禁食8h 左右。

5.4 樣品的保存和運輸

采樣完成后，樣品要遵循嚴格的保存和運輸規(guī)定，否則，很可能造成樣品失效。原則上，一種樣品只能裝置在一個容器里，并且要及時地密封。如果用的是塑料袋，保險起見，最好使用兩個，且兩個袋子都要封口，防止樣品漏出。采樣時如果氣溫較高，須配備冷藏設備；若時間短距離不遠的話，可用冰袋降溫。按照相應的存放要求及檢測目的，及時運送到檢測機構(gòu)。比如，需要進行細菌檢測或者寄生蟲檢測的樣品，冷藏后需要在24h 內(nèi)運送到實驗室檢測；需要檢測病毒的組織或棉拭子樣品，需在數(shù)個小時內(nèi)運送到檢測室；血液樣品如果現(xiàn)場沒有條件分離血清，必須在24h 內(nèi)送達實驗室進行處理、保存，若無法及時送檢，就要保證一直處于-20℃的冷凍環(huán)境中。在保存和運輸樣品時要避免光照、震動等因素，最大限度地進行平穩(wěn)運輸，確保其完整及穩(wěn)定性。

6 結(jié)語

樣品采集是基層動物疫病防控工作者常態(tài)化、基礎性的工作，如果采集過程不規(guī)范，用于實驗室檢測的樣品的代表性和針對性不能保證，動物疫病監(jiān)測工作的推進將會受到很大影響。動物疫病預防控制等相關部門應該加大經(jīng)費投入，加強培訓，組織相關人員學習并掌握樣品采集的操作技術流程和注意事項，保障樣品質(zhì)量，以利于有關工作的進一步開展。