稻瘟靈單克隆抗體的制備及評價

王幸幸，王耀宇，李曉娜，申超群，周 凱，2*，張 靜

（1．深圳市通量檢測科技有限公司，廣東 深圳 518038；2．九江學(xué)院 江西油茶研究研究中心，江西 九江 332005；3．煙臺海關(guān)技術(shù)中心，山東 煙臺 264000）

稻瘟靈（Isoprothiolane）又名異丙硫環(huán)、富士一號，化學(xué)名稱為1，3-二硫戊環(huán)-2-亞基丙二酸二異丙酯，是對光和熱較穩(wěn)定的有機(jī)硫環(huán)狀殺菌劑，具有內(nèi)吸性，屬高效內(nèi)吸殺菌劑［1］，主要用于防治水稻病菌及蟲害（如稻飛虱、葉蟬）。同時也是水稻稻瘟病的特效藥劑，對水稻紋桔病和白葉標(biāo)桔病有一定的防治效果，是一種高效、低毒、低殘留的有機(jī)殺菌劑［2］。水稻植株吸收稻瘟靈后會累積于葉組織，易于集中在穗軸和枝梗處，并污染大米及周圍環(huán)境［3］。近年來，隨著稻瘟靈的大量施用，一部分稻瘟靈會進(jìn)入土壤，造成土壤中的農(nóng)藥殘留，也會對土壤功能產(chǎn)生一定影響［4］，并進(jìn)一步污染作物。為了預(yù)防稻瘟靈過量施用可能存在的安全風(fēng)險，GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［5］中規(guī)定了玉米、稻米，甚至西瓜中稻瘟靈的殘留限量，其最低限量為0．05 mg/kg。

目前國家標(biāo)準(zhǔn)一般采用氣相色譜或與質(zhì)譜聯(lián)用方法將稻瘟靈與其他農(nóng)藥同時檢測［6-8］，由于不同農(nóng)藥性質(zhì)各異，采用單一提取同時檢測的方法不可避免地影響檢測穩(wěn)定性。盡管近年來氣相色譜、液相色譜等儀器分析方法的檢出限與穩(wěn)定性均有一定程度提高［3，9-10］，但這些方法樣品前處理復(fù)雜，無法滿足快速、大通量的檢測要求。

免疫分析方法操作簡便、快捷、通量高、靈敏度高，已經(jīng)成為食品安全快速檢測的主要方法之一［11］。抗體是免疫分析方法的重要因素，抗體質(zhì)量影響檢測的靈敏度與準(zhǔn)確性。目前僅有的1例稻瘟靈抗體制備的報道［12］是將丙二酸二異丙酯中酯鍵水解后偶聯(lián)蛋白，但兩個雙鍵水解并同時偶聯(lián)蛋白將大大影響抗體制備的成功率和特異性，且該方法制備的抗體與對硫磷等農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率超過20%。本研究基于稻瘟靈的分子特征，合成了稻瘟靈半抗原，并與蛋白偶聯(lián)制備抗體，通過常規(guī)免疫與雜交瘤細(xì)胞融合，成功篩選得到特異性識別稻瘟靈的單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)建立了稻瘟靈的快速免疫檢測方法，為檢測試紙條等產(chǎn)品的開發(fā)提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、材料與儀器

弗氏完全/不完全佐劑、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、TLC薄層層析板（GF254）、辣根過氧化物酶（HRP）、3，3＇，5，5＇-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）均為Sigma公司產(chǎn)品，稻瘟靈等農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr．Ehrenstorfer GmbH），N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC-HCl）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、羰基二咪唑（CDI）均購于阿拉丁試劑（上海）有限公司。Balb/c小鼠，雌性，8~9周齡，體重20~25 g。普通級雌性昆明鼠（廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心）；鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0保存于本實(shí)驗(yàn)室。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本，東京理化），Multiskan MK3酶標(biāo)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo），倒置顯微鏡（日本Olympus）。酶標(biāo)板自動洗滌機(jī)（美國Bio-tech），質(zhì)譜儀（美國，AB）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 半抗原的合成及鑒定稻瘟靈半抗原與抗體的合成路線如圖1所示，將1．6 g氫氧化鈉溶于10 mL水中，于10~20℃下將1．52 g二硫化碳和3．76 g二異丙基丙二酸酯混合液緩慢攪拌滴入。室溫下攪拌1 h后，加入25 mL水和5．16 g 2，3-二氯-1-丙醇，加熱至70℃，反應(yīng)完成后，用醚抽取，經(jīng)水洗、干燥、過柱提純得到稻瘟靈半抗原1。

圖1 稻瘟靈半抗原與抗體合成路線圖Fig．1 The synthesis schemes of isoprothiolane hapten and antigen

在25 mL單口瓶中加入半抗原1及等摩爾質(zhì)量的丁二酸酐，再加入10 mL無水吡啶并升溫至80℃反應(yīng)5 h，以TLC板監(jiān)控原料反應(yīng)完全后停止反應(yīng)。蒸干吡啶后，濃縮物直接過柱純化得終產(chǎn)物。將上述合成的半抗原2于質(zhì)譜負(fù)離子模式下進(jìn)行測定。

1.2.2免疫原與包被原的制備免疫原及包被原的制備均參考文獻(xiàn)［13-14］。

活潑酯法制備免疫抗原（稻瘟靈-BSA）：稱取70 mg稻瘟靈半抗原2溶于3 mL DMF中，加入36 mg NHS、41 mg EDC-HCl，室溫攪拌反應(yīng)6 h，離心后備用。稱取64 mg BSA溶于3．2 mL硼酸緩沖液（0．1 mol/L，pH 9．0）中，緩慢滴加0．9 mL上述離心后的活化液，室溫反應(yīng)4 h。采用PBS（0．01 mol/L，pH 7．4）進(jìn)行透析，每4 h換液1次，換液7~8次后，于4 000 r/min條件下離心5 min，上清液于-20℃保存。

混合酸酐法制備包被抗原1（稻瘟靈-OVA-1）：準(zhǔn)確稱取5．4 mg稻瘟靈半抗原2溶于200 μL DMF中，按順序分別加入4．27 μL三正丁胺和2．34 μL氯甲酸異丁酯，室溫下攪拌反應(yīng)1 h，離心后備用。將30 mg OVA溶于2 mL碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌下緩慢滴加100 μL上述離心后的活化液，室溫下攪拌反應(yīng)3 h，透析與保存步驟與活潑酯法制備免疫抗原稻瘟靈-BSA一致。

CDI法制備包被抗原2（稻瘟靈-OVA-2）：將10 mg稻瘟靈半抗原1與15 mg的CDI溶解于2 mL吡啶中，在室溫、避光條件下攪拌反應(yīng)120 min后，蒸干溶劑。取0．5 mL的DMF溶解上述活化的稻瘟靈半抗原1，并緩慢滴入OVA溶液（60 mg OVA溶于4 mL 0．1 mol/L的Na2CO3溶液中），同時不斷攪拌，室溫下避光反應(yīng)2 h，透析與保存步驟與活潑酯法制備免疫抗原稻瘟靈-BSA一致。

1.2.3 免疫方案取8周齡Balb/c雌性小鼠3只，將制備的免疫抗原與弗氏完全佐劑等量混合，完全乳化后，在小鼠腹部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，劑量為100 μg/只。每隔3周取免疫抗原與弗氏不完全佐劑等量混合，完全乳化后采用相同方式進(jìn)行多點(diǎn)注射，免疫4次后取免疫小鼠血清，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定血清效價與抑制率。選取效價和抑制率均較高的小鼠，取小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合，融合前5 d以兩倍免疫劑量強(qiáng)化免疫一次。

1.2.4 細(xì)胞融合及單克隆抗體制備小鼠脾細(xì)胞制備、與骨髓瘤細(xì)胞融合、陽性雜交瘤細(xì)胞淘篩等過程與Liu等［15］的方法一致。將篩選到的單個陽性克隆抗體擴(kuò)培后于液氮中保存。

1.2.5 腹水制備與抗體純化提前一周注射0．5 mL液體石蠟至昆明鼠腹腔中。將上述篩選的陽性克隆抗體擴(kuò)培并收集，通過腹腔注射入小鼠腹部，10~15 d后，待小鼠腹部明顯膨大時采集小鼠腹水。采用飽和硫酸銨沉淀法除去雜蛋白，使用protein A柱純化出抗體IgG。

1.2.6 間接競爭ELISA及包被原的篩選間接競爭ELISA法（icELISA）操作過程參考文獻(xiàn)［16］。采用棋盤滴定法優(yōu)化包被抗原濃度與抗血清工作濃度，以不同濃度的稻瘟靈-OVA-1、稻瘟靈-OVA-2分別包被酶標(biāo)板，小鼠抗血清倍比稀釋。選擇吸光值為1．0左右時的抗原濃度和抗體稀釋度作為工作濃度。

1.2.7 icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與特異性分析在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，以稻瘟靈質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)（其中B為添加稻瘟靈時的OD值，B0為空白組的OD值），采用OriginPro 8．5軟件按照四參數(shù)對數(shù)擬合繪制稻瘟靈檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇與稻瘟靈結(jié)構(gòu)相似的其他農(nóng)藥和化合物對建立的ic-ELISA方法進(jìn)行特異性評價。

1.2.8 樣品前處理與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)選取經(jīng)GB 23200．113-2018［6］檢測為陰性的蔬菜與谷物樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。蔬菜樣品取可食部分充分剁碎混勻，谷物樣品直接粉碎備用。分別按50、100、200 ng/g的比例添加稻瘟靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個水平做3個平行。稱取2 g加標(biāo)樣品，加入4 mL乙酸乙酯振蕩提取10 min，4 000 r/min離心20 min，收集有機(jī)層，加入1 g無水硫酸鈉振蕩1 min除水后，取上層有機(jī)相2 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用含甲醇5%的PBS緩沖液2 mL充分復(fù)溶。

2 結(jié)果與討論

2.1 半抗原設(shè)計、合成與鑒定

由于稻瘟靈分子本身不含可以偶聯(lián)的活潑基團(tuán)，無法直接偶聯(lián)蛋白。根據(jù)其分子特征，在二硫雜環(huán)戊烷中引申出活潑基團(tuán)可最大限度地保留稻瘟靈分子結(jié)構(gòu)。在合成其半抗原時引入一個帶有羥基的基團(tuán)，再通過該基團(tuán)和酸酐反應(yīng)制備出帶有羧基的半抗原，可進(jìn)一步延生手臂，將目標(biāo)分子暴露。其最小能量構(gòu)象下的分子靜電勢能面圖（圖2）顯示，半抗原中引入的活潑基團(tuán)并未對稻瘟靈分子靜電勢能產(chǎn)生影響，且半抗原2的手臂足以將分子暴露。半抗原1與2手臂的部分長度和靜電勢能差異較大，結(jié)合異原包被可提升抗體與藥物的識別強(qiáng)度［17］，故將半抗原2用于免疫原合成，以半抗原1制備包被原。經(jīng)過3步反應(yīng)，制備出稻瘟靈半抗原1與半抗原2。經(jīng)質(zhì)譜（負(fù)離子模式）鑒定（圖3），半抗原1為m/z319．1［M-H］-，半抗原2為m/z419．3［M-H］-。

圖2 稻瘟靈（A）及其半抗原1（B）和半抗原2（C）分子最小能量構(gòu)象下的分子靜電勢能面圖Fig．2 The electrostatic potential energy surfaces of the molecule in the minimum energy conformation of isoprothiolane（A）and its hapten 1（B）and hapten 2（C）molecules

圖3 稻瘟靈半抗原1（A）和半抗原2（B）的負(fù)離子質(zhì)譜圖Fig．3 Negative ion mass spectrograms of isoprothiolane hapten 1（A）and hapten 2（B）

2.2 抗血清效果分析

免疫的3只小鼠均產(chǎn)生免疫應(yīng)答，即產(chǎn)生了相應(yīng)抗體。采用棋盤滴定方式，選擇空白藥物時吸光值接近1．0且抑制率最大的抗血清與包被原質(zhì)量濃度作為最佳工作濃度，其中包被原質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，抗血清結(jié)果顯示小鼠B的效價最高，達(dá)25 000。以500 μg/L稻瘟靈標(biāo)準(zhǔn)品作為抑制藥物，對不同小鼠的血清進(jìn)行icELISA檢測。如表1所示，小鼠B的血清抑制率最高達(dá)82．88%，完全滿足要求。綜合考慮選擇小鼠B進(jìn)行細(xì)胞融合，并選擇稻瘟靈-OVA-2作為篩選的包被原。

表1 稻瘟靈抗血清抑制效果Table 1 Inhibitory effect of isoprothiolane antiserum

2.3 抗體靈敏度測定

經(jīng)過細(xì)胞融合篩選，發(fā)現(xiàn)有一個孔中的上清液可被稻瘟靈明顯抑制。結(jié)合顯微鏡克隆法與有限稀釋法對陽性孔雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得一株能穩(wěn)定產(chǎn)生抗稻瘟靈抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將制得的單克隆抗體記為mAb-DWL。收集小鼠腹水產(chǎn)生得到的抗體，測得其質(zhì)量濃度為5．2 mg/mL。采用最大抑制法篩選最適包被質(zhì)量濃度與抗體稀釋倍數(shù)，結(jié)果顯示當(dāng)包被質(zhì)量濃度為1 μg/mL，抗體稀釋倍數(shù)為1∶100 000時，抑制率最大（91．8%）。在最佳包被質(zhì)量濃度與抗體稀釋倍數(shù)下，建立稻瘟靈的icELISA抑制曲線，如圖4所示，獲得半抑制濃度（IC50）為55．2 ng/mL，線性范圍（IC20~IC80）為4．6~530．2 ng/mL，滿足國標(biāo)GB 2763-2021［5］對稻瘟靈的最大限量要求（玉米0．05 mg/kg、大米1 mg/kg、西瓜0．1 mg/kg）。

圖4 基于mAb-DWL的稻瘟靈間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．4 The standard curve of the indirect competition ELISA of isoprothiolane based on mAb-DWL

2.4 抗體特異性測定

進(jìn)一步對抗血清的特異性進(jìn)行考察。在異原包被（稻瘟靈-OVA-2）條件下，分別以稻瘟靈、近似結(jié)構(gòu)農(nóng)藥及相似功能農(nóng)藥作為抑制藥物繪制icELISA的抑制曲線，結(jié)果如表2所示。可以看出，制備的單克隆抗體與所有測試藥物之間的交叉反應(yīng)率（CR）均低于1%，可忽略不計。說明本方法制備的抗體可特異性地識別稻瘟靈農(nóng)藥，適用于后續(xù)試紙條等快檢產(chǎn)品的開發(fā)。

表2 單克隆抗體與稻瘟靈類似物的交叉反應(yīng)率Table 2 The cross-reaction rates of monoclonal antibody against the analogs

2.5 實(shí)際樣品檢測

根據(jù)實(shí)際檢測需要，選取小麥、水稻以及4種常見的蔬菜進(jìn)行樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。根據(jù)方法檢出限及GB 2763-2021對糧食及果蔬的限量標(biāo)準(zhǔn)，分別添加50．0、100．0、200．0 ng/g 3個水平的稻瘟靈標(biāo)準(zhǔn)品，混合均勻后進(jìn)行提取、檢測，每個樣品做3個平行，結(jié)果如表3所示。基于制備的單克隆抗體建立的icELISA方法的回收率為77．2%~116%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1．5%~7．1%，為基本滿足樣品的快速檢測與篩查需求。

表3 6種樣品中稻瘟靈的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of isoprothiolane in 6 samples（n=3）

3 結(jié)論

針對目前稻瘟靈免疫檢測產(chǎn)品的缺失，本文設(shè)計并合成了稻瘟靈抗原，制備出特異性識別稻瘟靈的單克隆抗體，并基于此構(gòu)建了稻瘟靈的icELISA檢測方法。研究顯示，在最大程度保留稻瘟靈分子特征結(jié)構(gòu)的前體下，從分子的二硫雜環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)中引申出活潑手臂偶聯(lián)蛋白制備的稻瘟靈抗原免疫后可產(chǎn)生抗體，同時，采用不同結(jié)構(gòu)與靜電勢手臂的異原包被，可顯著提升抗體與稻瘟靈的特異性識別。通過細(xì)胞融合等手段獲得單克隆抗體mAb-DWL，基于該抗體建立了稻瘟靈的icELISA法，其IC50為55．2 ng/mL，線性范圍為4．6~530．2 ng/mL。該方法對不同果蔬與谷物的回收率為77．2%~116%，適用于構(gòu)建免疫快速檢測方法實(shí)現(xiàn)對稻瘟靈的現(xiàn)場檢測。