PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達水平及其與雌孕激素的關系探討

鄒玥，劉穎

(吉林省婦幼保健院中心實驗室，長春 130000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)多出現無排卵性不孕，是一種生殖內分泌紊亂性疾病，臨床多表現為卵巢多囊性改變、月經失調、高雄激素血癥和持續性排卵障礙等，其病理特征主要是性激素分泌紊亂、胰島素抵抗[1]。雌、孕激素是影響子宮內膜生長發育、維持正常月經周期的重要性激素[2]。目前臨床大多以補充外源性雌、孕激素來改善PCOS患者月經失調、不孕等癥狀[3]；但其作用的有效靶點尚不明確，尋找雌、孕激素作用的內源性靶點可能為PCOS的臨床診療提供新的思路和參考。

微小RNAs(miRNAs)作為內源性小分子單鏈RNA，由19～24個核苷酸構成，參與人體內分泌、代謝、生長發育以及多種疾病的發生、發展過程，并且其數量和種類也隨疾病狀況和生理狀況而改變[4]。研究發現，卵母細胞發育與miR-320a表達水平顯著相關，而miR-145可以通過調控巨噬細胞的增殖和凋亡，在胚胎著床過程中發揮免疫耐受作用[5-6]，二者均可能與PCOS具有一定關系。目前，尚未有研究報道PCOS患者血清miR-320a、miR-145的表達情況，及其與PCOS患者雌孕激素水平是否相關。因此，本研究擬采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測PCOS患者血清miR-320a、miR-145的表達水平，并分析其與雌孕激素的關系，以期為臨床治療提供參考和借鑒。

資料與方法

一、研究對象

采用前瞻性研究，選取2019年5月至2021年7月于本院就診的92例PCOS患者作為PCOS組，另招募同期在本院健康體檢的90例育齡期女性作為對照組。

納入標準：(1)年齡≥20歲；(2)對照組經B超檢查卵巢形態正常，排除PCOS；(3)PCOS組符合PCOS的診斷標準[7]；(4)患者均簽訂知情同意書。

排除標準：(1)合并子宮肌瘤、卵巢囊腫等生殖器官器質性疾病；(2)合并糖尿病等內分泌疾病或自身免疫性疾病；(3)合并惡性腫瘤及嚴重臟器功能障礙；(4)合并精神障礙；(5)近6個月內使用過激素類藥物。

二、研究方法

1.樣本采集：抽取空腹靜脈血6 ml(對月經不規律者于B超檢查未見優勢卵泡時抽取肘靜脈血，對于月經規律者在月經周期3～5 d抽取肘靜脈血)，靜置2 h后放入離心機，以3 500 rpm離心5 min，吸取上層血清，將其均勻分為兩份，置于離心管中，放入-80℃冰箱中保存。

2.Real-time PCR：使用Trizol試劑盒(Invitrogen，美國)提取血清中總RNA，用cDNA合成試劑盒(北京天根)進行反轉錄，最后采用Real-time PCR法檢測血清miR-320a和miR-145相對表達量。miR-320a采用定量PCR試劑盒(FP411，Cell Signaling Technology，美國)進行Real-time PCR反應，反應條件：95℃ 15 min，94℃ 20 s，65℃ 30 s，72℃ 34 s，5個循環，94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個循環。miR-145亦采用定量PCR試劑盒(FP401，北京天根)進行Real-time PCR反應，反應條件：94℃ 10 min，94℃ 15 s、60℃ 30 s，45個循環，72℃ 5 min。均以U6為內參。采用2-ΔΔCt計算miR-320a和miR-145相對表達情況。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR反應引物序列

3.雌孕激素檢測：采用電化學發光法進行檢測，使用全自動化學發光儀(Cobas e411，羅氏，德國)檢測血清E2、孕酮水平，檢測中所需的試劑盒均由德國羅氏公司提供。

三、統計學分析

結 果

一、兩組患者的臨床資料比較

兩組患者的年齡和體質量指數(BMI)比較均無顯著性差異(P>0.05)；電化學發光法檢測結果顯示，PCOS組患者血清E2和孕酮水平均顯著低于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者臨床資料比較[(-±s)，M(Q1，Q3)]

二、兩組患者血清miR-320a、miR-145表達水平比較

Real-time PCR結果顯示，PCOS組血清miR-320a和miR-145表達水平均顯著低于對照組(P<0.05)(圖1)。

與對照組比較，*P<0.05。圖1 兩組患者血清miR-320a和miR-145表達水平比較

三、PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達水平與雌孕激素水平的相關性分析

Pearson相關分析結果顯示，PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達與E2和孕酮水平均呈顯著性正相關(P<0.05)(表3，圖2、3)。

表3 PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達水平與E2、孕酮水平的相關性分析

A：血清miR-320a與E2的相關性分析；B：血清miR-320a與孕酮的相關性分析。圖2 血清miR-320a與E2、孕酮的相關性分析

A：血清miR-145與E2相關性分析；B：血清miR-145與孕酮相關性分析。圖3 血清miR-145與E2、孕酮相關性分析

討 論

隨著人民生活方式的轉變和生活壓力的增加，女性PCOS發病率為5%～21%，并呈現上升趨勢[8]。PCOS患者多伴有閉經、不孕、多毛及肥胖等癥狀，增加了并發心血管疾病和2型糖尿病的風險，嚴重者甚至出現自然流產現象，影響患者的遠期健康及生育問題[9]，故需引起臨床的高度重視。PCOS的發生與非酒精性脂肪肝病、環境因素、血脂異常、代謝綜合征及遺傳等有關，但PCOS的具體病因或發病機制尚未明確，且徹底治愈較難。目前，藥物治療是PCOS患者臨床治療的首選方式，通過外源性激素調節體內雌、孕激素水平，雖然能在一定程度上改善臨床癥狀，但并未能從根本上解決問題，且易引發患者代謝紊亂[10]。因此，亟需尋找可以調節雌、孕激素的內在靶點，以期為治療PCOS提供新方向。

本研究結果發現，PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，推測miR-320a、miR-145可能參與PCOS的病理過程。PCOS患者月經周期不穩定以及不孕的重要因素是卵泡生長受抑制導致其發育異常。miRANs是內源性非編碼小分子RNA，作為轉錄后調控的關鍵因子，其可以調控多種生物過程，并參與多種疾病的發生、發展。miR-320a具有抗炎、調控細胞增殖和抗氧化的作用，其表達水平與卵母細胞發育情況聯系密切。既往研究發現，PCOS患者外周血miR-320a表達水平顯著低于正常女性[11]，本研究結果與之相符。有研究發現，miR-320a通過直接靶向SF-1和E2F-1調節卵巢顆粒細胞增殖，維持卵泡生長發育，miR-320a與PCOS的發生密切相關[12]。另有研究發現，PCOS患者血清miR-145可以通過激活細胞外信號調節激酶來抑制顆粒細胞的增殖，促進細胞凋亡進而參與PCOS的發生發展；與對照組比較，PCOS患者血清miR-145表達水平呈現顯著下降的趨勢[13]。此外，胰島素受體底物(IRSI)作為miR-145的靶基因，其蛋白表達受到miR-145的抑制，進而miR-145抑制了PCOS患者顆粒細胞的增殖。

本研究結果顯示，PCOS患者血清孕酮和E2水平均顯著低于對照組(P<0.05)，說明PCOS患者雌激素、孕激素均低于健康育齡女性。雌孕激素作為影響子宮內膜的重要因素之一，在其發揮調控作用后，會引起子宮內膜出現周期性變化，從而形成月經周期(規律的月經出現是生殖功能成熟的標志)[14]。E2作為由卵泡分泌的一種雌激素，可以促進下丘腦-垂體系統促性腺激素釋放激素-垂體促性腺激素(GnRH-Gn)表達，發揮正反饋作用，進而促進排卵[15]，而PCOS患者由于下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常，故E2水平也較低。另外，E2可以刺激輸卵管的發育及蠕動，促進卵母細胞或受精卵著床。此外，雌激素還可以間接反應卵母細胞的質量，而卵母細胞的質量則影響卵母細胞體外成熟，并影響PCOS患者生育及妊娠結局[16]。孕激素是由人體卵巢顆粒黃體細胞分泌產生，主要以孕酮為代表，作為一種天然孕激素，它是妊娠維持所必須的激素，具有抑制排卵，促進子宮內膜分泌的作用[17]。PCOS是一種常與無排卵相關的異質性疾病，由于PCOS患者成熟卵泡發育少，無法排卵，導致雌激素保持在低水平的閾值范圍，并且卵巢不能分泌孕激素，因此PCOS患者雌孕激素水平較低，子宮內膜發育遲緩，導致正常月經周期和早期妊娠不能維持，影響生育。

Pearson相關性分析顯示，PCOS患者血清miR-320a、miR-145表達與E2和孕酮水平均呈顯著正相關(P<0.05)，提示臨床干預中可通過靶向調控miR-320a、miR-145的表達來調節PCOS患者雌孕激素水平，為臨床治療PCOS患者提供新方向。雌激素局部合成的主要場所是顆粒細胞，可以對卵泡的生長產生刺激，并給其它組織提供內分泌信號[18]。相關研究發現，miR-320a靶向作用于轉錄因子E2F1和SF-A，促進顆粒細胞增殖，促進雌激素合成以及孕酮產生[19]。miR-145參與炎癥和免疫過程，以及細胞的分化、代謝、凋亡等，并在其中發揮重要作用，同時對IRS1具有靶向抑制作用，進而起到抑制細胞增殖的效果。另外，miR-145可以通過顆粒細胞中的P13K/AKT信號通路，使細胞代謝中的胰島素水平得到調節，促使PCOS患者E2和孕酮表達水平升高。

綜上所述，PCOS患者血清miR-320a、miR-145的表達水平顯著低于正常育齡期女性，且血清miR-320a、miR-145表達水平與血清E2、孕酮水平呈正相關，提示臨床干預中可通過調控miR-320a、miR-145的表達來調節PCOS患者雌孕激素水平。但是，由于本研究納入的樣本量較少，研究結果可能存在一定的局限性，后續研究仍需進一步擴大樣本量加以驗證，以期為臨床干預提供一定參考和依據。