杠香乙醇提取物對小鼠急性毒性實驗研究

何金美，張丹雁，范紫穎，孫楷填

（1.廣州中醫藥大學第三附屬醫院藥學部，廣東 廣州 510360；2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

杠香，又名龍肝香、藤沉香、云香，為豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）含樹脂的根、根莖及藤莖，主產于云南、貴州、四川等地，東南亞地區亦有分布。杠香在民間有著悠久的藥香兩用歷史，西南少數民族地區習用杠香泡茶、浸酒，單方或組方內服用于治療感冒、咳喘、急慢性胃腸炎等，外用治療皮膚潰瘍、刀傷、燒燙傷等[1，2]。此外，杠香木質致密，香氣誘人，常用作熏香或雕刻藝術品流行于香料文玩市場，綜合開發利用前景十分廣闊?，F代研究表明，杠香含有揮發油、糖類、有機酸類、黃酮類等成分，并具有抗氧化等藥理活性[3]。林如意等[4]采用紙片擴散法對杠香的4 種提取物進行了抗菌活性研究，結果表明杠香4 種提取物對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）均顯示不同程度的抑菌效果。由于杠香目前僅限于我國西南民間地區進行藥用，未進行系統的藥理藥效研究，本研究將參照《藥物單次給藥毒性研究技術指導原則》[5]對杠香進行急性毒性研究，為后續毒理藥效等研究提供參考依據，促進黃檀屬藥用植物新資源的開發。

1 材料與儀器

1.1 材料來源 杠香，產自云南省，由廣州中醫藥大學張丹雁鑒定其來源于豆科黃檀屬植物滇黔黃檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）含樹脂的藤莖，樣品保存于廣州中醫藥大學中藥學院中藥鑒定實驗室。

1.2 實驗動物 SPF 級昆明種健康成年小鼠30 只，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（粵）2013-0034；體重18～22 g，雌雄各半，分籠適應性飼養1 周；飼養環境溫度20 ℃～25 ℃，相對濕度45%～70%，光照以12 h 為周期明暗交替。

1.3 儀器與試劑 DS-1500A 分析天平（佛山市拓普域電子有限公司）；脫水機、包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；正置光學顯微鏡（Nikon Corporation）；多聚甲醛、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、H&E 染液、分化液、返藍液（國藥集團化學試劑有限公司）；以上試劑均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 杠香乙醇提取物的制備 取干燥杠香樣品適量，粉碎機粉碎后過100 目篩，稱取過篩后的杠香粉末20 g 置于圓底燒瓶中，根據預實驗結果，按照液料比1∶10，提取時間2 h，提取溫度80 ℃，乙醇濃度60%，進行水浴回流提取，重復提取2 次，合并濾液，減壓濃縮成浸膏，凍干成粉，收集得到干燥固形物1.516 g，本品提取率為7.58%，即1 g 提取物相當于生藥材13.19 g，干燥環境下密封保存備用，使用時以蒸餾水配制成所需濃度的混懸液。

1.4.2 預實驗 SPF 級昆明種小鼠10 只，雌雄各半，實驗前禁食不禁水6 h，以能通過灌胃針的最大濃度醇提物折合生藥材為1.06 g/ml 為給藥劑量，按照小鼠體重，以0.4 ml/10 g 計算最大給藥體積，一次性灌胃給藥，連續密切觀察14 d，結果小鼠狀況良好，無一死亡，無法計算半數致死量（LD50），故正式實驗采用最大給藥量法[6-9]進行。

1.5 杠香乙醇提取物對小鼠的急性毒性實驗 SPF級昆明種小鼠20 只，雌雄各半，實驗前禁食不禁水6 h，隨機分為空白組和杠香組，每組雌、雄各5 只，分籠飼養。依據預實驗結果以能通過灌胃針的最大濃度醇提物折合生藥材為1.06 g/ml 為給藥劑量，按照小鼠體重，以0.4 ml/10 g 計算最大給藥體積，一次性灌胃給藥，空白組給予同等體積的蒸餾水。給藥后6 h 內密切觀察小鼠的行為狀態，4 h 后給予充足的食物和飲水。

1.6 觀察指標

1.6.1 動物一般狀態觀察 給藥結束后第2 天起，每天密切觀察小鼠，連續觀察14 d，期間給予小鼠充足的飲水和食物，以《藥物單次給藥毒性研究技術指導原則》[5]中的一般觀察指征為標準。于實驗前及給藥后第3、6、9、12、14 天對小鼠體重及總進食量進行記錄。若小鼠中途死亡，及時取出解剖觀察病變情況。

1.6.2 動物臟器取材及觀察 觀察期結束后頸椎脫臼處死所有小鼠，迅速解剖，肉眼觀察各主要臟器的病變情況，同時摘取小鼠的肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟，用生理鹽水沖洗干凈，吸去表面多余水分后立即精密稱重，計算臟器系數，并將臟器放入4%中性多聚甲醛固定液中固定后切片、染色進行組織病理學觀察。

1.7 統計學方法 使用SPSS 22.0 統計軟件對數據進行處理分析，計量數據用（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠一般狀況比較 給藥后兩組小鼠均未出現死亡情況，空白組小鼠整體較為活潑好動，四肢靈活，皮膚、口、鼻等未發現異常分泌物，眼球無異樣，呼吸正常，毛發干凈、有光澤，飲水、進食、排尿及糞便正常。杠香組小鼠活動相對減少，喜靜臥，1 h內全部恢復正常，皮膚、口、鼻等未發現異常分泌物，眼球、呼吸、毛發、飲水、進食、排尿及糞便與空白組比較基本無異樣。第14 天解剖所有小鼠，與空白組比較，杠香組小鼠各臟器大小、形狀、顏色、質地肉眼觀察正常，沒有發現壞死、肥大增生或萎縮等明顯病理病變。

2.2 兩組小鼠體重及總進食量比較 灌胃后14 d 內，兩組小鼠體重總體呈增長趨勢，杠香組雌、雄小鼠給藥前后體重與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。觀察期間，杠香組雌性小鼠給藥前后總進食量低于空白組，而雄性小鼠給藥前后總進食量高于空白組，其他無異常情況，見表2。

表1 兩組小鼠體重比較（，g）

表1 兩組小鼠體重比較（，g）

表2 兩組小鼠總進食量比較（n，g）

2.3 兩組小鼠各臟器系數比較 兩組雌、雄小鼠主要臟器重量均在合理范圍內；杠香組雌、雄小鼠肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟臟器系數分別與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 兩組小鼠各臟器系數比較（）

表3 兩組小鼠各臟器系數比較（）

2.4 杠香急性毒性實驗對兩組小鼠主要臟器病理形態的影響 ①空白組小鼠肝細胞形態結構完整、大小正常，細胞核大而圓，周圍未發現炎癥細胞浸潤，肝細胞索以中央靜脈為中心，呈放射狀排列。與空白組比較，杠香組小鼠肝組織未發現明顯異常；②空白組小鼠心肌細胞形態、大小、染色均正常，結構完整，未發現炎癥細胞浸潤，肌纖維排列有序，間隙未見異物。與空白組比較，杠香組小鼠心臟組織未發現明顯異常；③空白組小鼠脾組織結構完整，白髓分散在紅髓之中，白髓和脾小梁清晰可見，有明顯的分界，淋巴小結、淋巴細胞等均未見異常。與空白組比較，杠香組小鼠脾臟組織未見明顯損傷；④空白組小鼠肺組織充滿許多大大小小呈空泡狀的肺泡，多個肺泡共同開口形成肺泡囊，肺泡囊內部透明無異物，支氣管結構完好，管徑較大，管壁厚，無變性和壞死，未發現炎癥細胞浸潤。與空白組比較，杠香組小鼠肺組織未見明顯損傷；⑤空白組小鼠腎臟組織可見腎小球和腎小管，腎小球形態完好、大小適中，囊腔無異常，周圍未發現炎癥細胞浸潤，腎小管管壁完好，管腔內無異常。與空白組比較，杠香組小鼠腎臟組織無明顯損傷?？瞻捉M與杠香組雌、雄小鼠各隨機選取一張病理切片圖，見圖1。

3 討論

急性毒性是指機體一次（或24 h 內多次）接觸外來化合物之后所引起的中毒效應[10-12]。急性毒性試驗是藥物安全性評價的第一步[13，14]，常用方法有多種，如最大給藥量法、最大耐受量法[5]、上下法[15]、固定劑量法[16]等，大部分中藥、天然藥物的急性毒性一般較低，可采用最大給藥量法進行急性毒性研究[5，17]。

杠香作為西南少數民族地區習用香藥，藥用歷史悠久。其在心血管、胃腸道疾病或跌打損傷、燒燙傷等方面的治療效果良好，且資源豐富，可用于補充黃檀屬藥用植物資源，應用前景廣闊。但目前有關其藥理藥效方面研究甚少，且缺乏相關的安全性研究報道。

本研究針對杠香的乙醇提取物進行了系統的小鼠急性毒性試驗，主要通過以下幾個指標評價其安全性：①體重和進食量的變化在一定程度上可以反映出動物的中毒情況。當藥物對消化道具有刺激性時，消化道損傷可能造成動物拒食，飼料消耗量減少；若食物的消化和吸收受到影響，則會造成動物體重停止增長，甚至減輕；②心、肝、脾、肺、腎是重要的功能器官，經常會受到有毒物質損害，因此對其進行檢查，可以發現潛在的器官靶向毒性[18]。本研究通過預實驗確定無法采用半數致死量法進行，從而選用了適合杠香的最大給藥量法，實驗結果顯示，杠香乙醇提取物折合生藥材最大給藥劑量42.4 g/kg 一次性灌胃給藥后，小鼠在14 d 內未發現明顯中毒反應，小鼠的體重和進食量均未產生明顯變化，主要臟器沒有明顯損傷，臟器系數沒有明顯差異。參考2020 版藥典中黃檀屬代表藥材降香日用劑量為9～15 g[19]，上述實驗劑量大約相當于60 kg 成人日用劑量的170～280 倍[20-22]，在此劑量下未發現明顯的急性毒性作用，說明杠香通過口服給藥具有較高的安全性，實驗結果與預期相符合。

綜上所述，本研究為杠香的安全用藥提供了一定的參考，但后續還需對杠香進行長期毒性實驗，以更加全面地評價其安全性。此外，為進一步開發利用杠香，還需對其化學成分以及藥理藥效等方面進行深入研究。