免疫親和柱凈化-高效液相色譜快速測定玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇方法初探

沈 萍 蔣 晨 （江蘇省宜興市農(nóng)林局 214205）汪小平 （吉安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西省吉安市 343000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON），又稱嘔吐毒素（Vomitoxin），屬單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌等多種鐮刀菌在陰涼、潮濕的環(huán)境下生長產(chǎn)生，在自然界中廣泛存在。DON主要污染玉米、小麥、大麥等糧食作物及其制品[1]，其理化性質(zhì)非常穩(wěn)定，在儲藏及加工過程中很難被破壞，且長期貯存毒性基本不變，更有較強(qiáng)的抗熱性（在121 ℃高溫下處理30 min，僅有少量被破壞）[2]。同時(shí)，DON可在人和動(dòng)物體內(nèi)蓄積，極易產(chǎn)生致畸性、神經(jīng)毒性、胚胎毒性等，引起人和動(dòng)物生長嚴(yán)重受阻、免疫機(jī)能減退、肌肉協(xié)調(diào)性降低及嘔吐等癥狀，因此，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）已將DON列為3類致癌物[3-5]。

雖然DON的危害已被人們熟知，但不同糧食品種中DON的快速、準(zhǔn)確檢測仍是難點(diǎn)。目前，糧食中DON的檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）[6]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[7,8]和高效液相色譜法（HPLC）[9-11]等。但TL C法操作繁瑣、污染大，屬于半定量測定；ELISA法雖操作簡便、靈敏度較高，但特異性較差，容易出現(xiàn)假陽性；所以，HPLC法是目前最常用的DON檢測方法，具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。在此背景下，筆者采用免疫親和柱凈化樣品、HPLC法測定玉米中的DON，以便建立一種快速、準(zhǔn)確測定玉米中DON含量的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米（市售），DON標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%，美國Sigma公司），高純氮（四川喬源氣體有限公司），DON免疫親和柱（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要試劑和儀器

甲醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、聚乙二醇8000（均為分析純，成都市科龍化工試劑廠），甲醇（色譜純，美國Fisher公司）。

島津高效液相色譜儀（LC-20）帶熒光檢測器（RF-10AXL，日本島津公司），電子天平（BT124，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），移液槍（ZX17224 20～200μL、ZX11858 100～1 000μL，美國Thermo Electron公司），全水溫?fù)u瓶柜（HYG-A，江蘇省太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52B，上海亞榮生化儀器廠），離心機(jī)（Centrifuge 5810R，德國Eppendof公司）。

1.3 DON樣品的提取與凈化

將玉米樣品粉碎后，過40目篩，然后準(zhǔn)確稱取（25.00 g）樣品，加5 mL聚乙二醇8000，再加100 mL蒸餾水，于200 轉(zhuǎn)/min震蕩提取20 min，過濾，取1 mL濾液于一次性注射器中，將濾液以1～2滴/s的速率通過DON免疫親和柱，待濾液排干后，用10 mL PBS緩沖溶液洗滌2次，流速2～3滴/s，待液體再次排干后，上4 mL甲醇，用樣品瓶接洗脫液，流速1～2滴/s，洗脫后液體用氮?dú)獯抵两桑? mL流動(dòng)相混勻，于10 000 轉(zhuǎn)/min離心5 min后，取上清液，供HPLC測定。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18柱（150 mm×4.6 mm,5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（2∶8, v/v），柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為220 nm，進(jìn)樣體積為10 μ L，檢測時(shí)間為15 min。

1.5 DON標(biāo)準(zhǔn)工作液的配置

準(zhǔn)確稱取1 mg DON標(biāo)準(zhǔn)品，用10 mL色譜純甲醇溶解，并用10 mL棕色容量瓶定容，將上述溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液保存于-20 ℃冰箱。準(zhǔn)確移取100μL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，氮?dú)獯蹈桑俜謩e用流動(dòng)相配成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、4 mg/L的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.6 樣品中DON含量測定與計(jì)算

將DON標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液按上述色譜條件測定，得到DON標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過外標(biāo)法定量分析，計(jì)算出樣品中DON含量。樣品中DON含量計(jì)算公式為：Y=[M×(V1/V2)×(M1/M2）]，其中，Y為原料中DON含量，μg/kg；M為進(jìn)樣體積中DON含量,μg；V1為提取樣品所用溶液體積，mL；V2為進(jìn)樣體積,μL；M1為原料質(zhì)量，kg；M2為提取樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)品與DON玉米樣品色譜圖

按1.4色譜條件，分別對標(biāo)準(zhǔn)品和玉米樣品中的DON進(jìn)行測定，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品中D O N保留時(shí)間為8.7 7 mi n，而根據(jù)G B/T 23503-2009中色譜分離條件，測試樣品中DON保留時(shí)間為12.98 min，與之相比，本方法的試劑和檢測時(shí)間可節(jié)約32.4%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品與玉米樣品中DON的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

將配制好的DON標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，按色譜條件進(jìn)行分析，并將DON標(biāo)準(zhǔn)溶液中質(zhì)量濃度（C）與峰面積（A）進(jìn)行線性回歸分析，得到線性回歸方程Y=47.35X+2.31，R=0.9998。DON的濃度在0.1～4 mg/L時(shí)，質(zhì)量濃度（C）與峰面積（A）呈良好的線性相關(guān)性。根據(jù)DON測定產(chǎn)生的3倍信噪比（S/N）計(jì)算出該方法的檢出限為0.02 mg/kg，以10倍S/N得出該方法的定量下限為0.067 mg/kg，能滿足國家對玉米中DON的限量要求（≤1 mg/kg）。

2.3 回收率與精密度

在25.00 g不含DON玉米樣品中，分別加入低、中、高3個(gè)水平的DON標(biāo)準(zhǔn)品，按上述實(shí)驗(yàn)方法對樣品進(jìn)行處理與測定，并通過加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，比較本研究方法與GB/T 23503-2009差異。結(jié)果表明，本方法具有很高的準(zhǔn)確度，見表1。

表1 本方法與GB/T 23503-2009測定DON含量結(jié)果對比

通過加標(biāo)回收率試驗(yàn)，對本試驗(yàn)方法進(jìn)行了精密度和準(zhǔn)確度測定，結(jié)果表明，DON的平均回收率均大于80.0%，RSD均小于6.0%，說明本試驗(yàn)方法精密度、準(zhǔn)確度能滿足分析要求。見表2。

表2 不同加標(biāo)量的樣品回收率及精密度

3 結(jié) 論

本研究建立了一種免疫親和柱凈化-HPLC法檢測玉米中DON的分析方法，檢出限為0.02 mg/kg，定量下限為0.067 mg/kg。同時(shí)，通過對玉米樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，得出該方法具有較高的回收率與精密度，回收率均大于80%、精密度均小于6.0%。此外，從樣品的提取、凈化到檢測，整個(gè)過程耗時(shí)不足1 h，從實(shí)際玉米樣品檢測結(jié)果看，該方法簡便易行、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、檢測限低，適合于大批量樣品檢測，值得推廣應(yīng)用。

[1]王金勇,劉穎莉,關(guān)舒.2013年中國飼料和原料霉菌毒素檢測報(bào)告[J].中國畜牧雜志, 2013(4):39-42.

[2]Karlovsky P.Biological detoxification of the mycotoxin deoxynivalenol and its use in genetically engineered crops and feed additives[J].Applied microbiology and biotechnology, 2011,91(3):491-504.

[3]Pestka J J. Deoxynivalenol: Toxicity, mechanisms and animal health risks[J].Animals Breeding and Feed,2008,137(3):283-298.

[4]朱孟麗.高效液相色譜法對谷物中嘔吐毒素的測定[J].糧食與飼料工業(yè),2005(8):42-43.

[5]張鵬,張藝兵,鮑蕾,等.出入境糧谷中嘔吐毒素檢測方法的研究[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)刊,2003,13(2):8-10.

[6]Putnam M L, Binkerd K A.Comparison of a commercial ELISA Kit and TLC for detection of deoxynivalenol in wheat[J]. Plant disease, 1992,76(10):1078.

[7]Sinha R C,Savard M E,Lau R.Production of monoclonalantibodies for the specific detection of deoxynivalenol and 15-acetyldeoxynivalenol by ELISA[J].Journal of agricultural and food chemistry, 1995,43(6):1740-1744.

[8]楊丹妮,汪海峰.小麥中嘔吐毒素的ELISA和HPLC法檢測[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(3):1269-1270.

[9]MacDonald S J, Chan D, Brereton P, et al.Determination of deoxynivalenol in cereals and cereal products by immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography: interlaboratory study[J].Journal of Aoac international,2005,88(4):1197-1204.

[10]王偉,劉安法,李明奇,等.免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測小麥中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[J].糧食與飼料工業(yè),2013,12(1):60-61.

[11]毛丹,許勇,張道廣,等.HPLC法測定糧谷中的嘔吐毒素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(12):2207-2208.