糞菌移植技術(shù)的研究進展及其應(yīng)用

李元元，吳妍妍，張文舉

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

動物腸道內(nèi)含有大量的微生物，如細(xì)菌、真菌、古菌等[1]。腸道微生物對宿主的健康至關(guān)重要，不僅可以改善宿主營養(yǎng)、調(diào)節(jié)代謝，還可以調(diào)控腸道上皮發(fā)育、誘導(dǎo)先天性免疫等，其功能相當(dāng)于機體的一個重要“器官”[2]。腸道菌群失衡可導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，如腹瀉、胃腸功能紊亂等[3]。糞菌移植(Fecal microbiotal transplantation,FMT)則可通過健康供體糞菌液中的功能菌群恢復(fù)患者正常腸道菌群結(jié)構(gòu)達(dá)到治療某種疾病的目的。我國醫(yī)學(xué)家葛洪曾在《肘后備急方》中記載了利用人糞便懸液治愈食物中毒和重腹瀉等疾病[4]；在《本草綱目》中李時珍也有使用糞菌移植治療多種胃腸道疾病，如腹瀉、嘔吐、便秘等疾病的記載[5]。1958年，美國外科醫(yī)生Eiseman 等[6]通過糞菌移植對患有嚴(yán)重偽膜性腸炎的4名患者進行治療，并取得了良好療效；之后的20年，糞菌移植一直未得到重視；直到1978年，難辨梭狀芽胞桿菌感染(CDI)被認(rèn)為是偽膜性腸炎的主要原因，并與抗生素的使用密切相關(guān)，于是糞菌移植又重新進入人類臨床研究領(lǐng)域。隨著糞菌移植技術(shù)的深入研究，此技術(shù)已被證實是治療難辨梭狀芽孢桿菌感染的一種安全有效的方法；同時越來越多的研究也表明，糞菌移植在其他胃腸道疾病治療中也發(fā)揮著重要的作用[7]。近年來，隨著糞菌移植技術(shù)在臨床上的成功應(yīng)用，以及在畜牧業(yè)抗生素濫用突出的背景下，人們開始嘗試將糞菌移植應(yīng)用到動物生產(chǎn)中，且其應(yīng)用研究呈上升趨勢，并取得了一定的進展。因此，本文就糞菌移植技術(shù)的研究新進展及其應(yīng)用做一綜述，以加強科研工作者對這一新技術(shù)的深入了解，并為今后深入研究糞菌移植提供新思路。

1 糞菌移植的實施過程

為確保糞菌移植技術(shù)的有效性，消除受體心理障礙，隨著此技術(shù)的研究進展，其實施過程(供體選擇、菌液制備和菌液移植等)正逐漸標(biāo)準(zhǔn)化。

1.1 糞菌移植供體的選擇 糞菌移植類似于“器官”移植，存在著疾病傳播的風(fēng)險，因此必須對供體進行嚴(yán)格的感染性疾病的篩查，以確保糞菌移植的安全性和有效性[8]。糞菌移植的供體可以選擇與受體關(guān)系密切的個體，如夫妻、父母、子女等，也可從健康的捐贈者中進行選擇。近些年，糞菌移植在人類臨床的應(yīng)用越來越多，為確保治療方案的標(biāo)準(zhǔn)化、臨床實踐的安全性和合理性等，2016年糞菌移植歐洲共識會議中來自10個國家的28名專家，對人類適應(yīng)癥、供體選擇標(biāo)準(zhǔn)、菌液的制備以及移植的實施等給出指南[9]。在人類供體選擇時，首先通過問卷形式對供體病史和危險因素進行排除；了解是否使用非法藥物；近6個月是否有紋身、人體穿孔等行為；是否有胃腸道、新陳代謝和神經(jīng)系統(tǒng)疾病；了解供體超重和肥胖情況；近3個月使用抗生素、免疫抑制劑，接受化療情況。供體年齡優(yōu)先選擇小于60歲，若為受體親密接觸的健康伴侶，年齡范圍可適當(dāng)放寬。合適的 FMT 供體在捐贈前應(yīng)至少提前4周進行血液和糞便檢查，血液檢查如巨細(xì)胞病毒、人類嗜 T 細(xì)胞病毒Ⅰ型及Ⅱ型抗體等；糞便檢查如梭狀芽胞桿菌、沙門菌、志賀菌等腸道病原體等；特殊情況下糞便檢查還包括霍亂弧菌和李斯特菌、幽門螺桿菌糞便抗原、輪狀病毒等[10]。

在動物研究應(yīng)用中，胡軍等[11]等根據(jù)我國豬養(yǎng)殖的生產(chǎn)實踐和人類臨床醫(yī)學(xué)糞菌移植的操作標(biāo)準(zhǔn)，提出了豬的糞菌移植供體篩選的8個原則；通過對豬系譜調(diào)查和體型外貌進行觀察、豬行為學(xué)觀察和臨床檢查、豬血清學(xué)檢測、豬糞便樣品細(xì)菌和病毒檢測等方法對供體指標(biāo)進行檢測。朱見深[12]在進行家禽雞的糞菌移植前通過比較分析無特定病原體(Specific pathogen free,SPF)雞和商品蛋雞的糞便菌群與大腸埃希菌抗藥性，對供體進行了篩選，確定將SPF雞作為降低抗藥性的理想供體。糞菌移植在人類臨床上研究應(yīng)用較多，近年來，糞菌移植在哺乳動物仔豬中也得到了廣泛研究，而在反芻動物中并沒有獲得很好的開發(fā)應(yīng)用，對供體選擇的系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)還未見相關(guān)報道。

1.2 糞菌液制備 FMT中糞便菌液的制備主要包括糞便稀釋、過濾和保存等。將新鮮的糞便放入盛有無菌生理鹽水(通常推薦用3～5倍體積)的已滅菌的容器中制成糞便懸液，用無菌紗布、過濾器等初步除去糞便懸液中大顆粒雜質(zhì)，再用不同孔徑的無菌不銹鋼篩依次除去顆粒較小的雜質(zhì)。然后對過濾后的糞便懸液進行離心，收集上清液，用無菌生理鹽水重懸菌體沉淀制得糞便菌液。隨后可將新鮮的糞便菌液進行移植，也可加入甘油(終濃度為100 g/L)在-80 ℃凍存，待使用時對糞便菌液進行復(fù)蘇后再移植至受體胃腸道內(nèi)[9-10]。在空氣中均質(zhì)或經(jīng)過凍融循環(huán)，糞便微生物菌群存活率會有所降低，所以所有菌液制備過程中應(yīng)減少在空氣中暴露的時間且避免重復(fù)冷凍和解凍[13]。為提升菌液制備效率，使得微生物活性得以最大限度地保存，智能化糞菌分離系統(tǒng)已成功研發(fā)應(yīng)用，此系統(tǒng)的開發(fā)實現(xiàn)了糞菌分離、提純過程的智能化和標(biāo)準(zhǔn)化[14]。

1.3 糞菌液移植途徑 目前，糞菌移植途徑有通過胃鏡下噴灑糞菌或者胃鏡下留置鼻空腸管等方式進行中消化道移植；通過灌腸以及腸鏡噴灑糞菌或者腸鏡下留置置管，再進行注入糞菌途徑的下消化道移植；近些年也有通過口服糞菌制劑冷凍膠囊來治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究[15]。對于選擇哪種菌液移植途徑主要取決于患者個體情況、病變部位以及疾病的特點[16]。

Khan等[17]通過上消化道途徑和下消化道途徑對543例CDI復(fù)發(fā)患者進行FMT治療比較分析，發(fā)現(xiàn)2種治療途徑效果無差異。在動物研究應(yīng)用中，朱見深[12]通過泄殖腔接種和噴霧接種的形式給腸道幾乎無菌的1日齡SPF雛雞進行糞菌移植，利用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)對受體雛雞腸道菌群的發(fā)展變化進行了檢測；張亞楠[18]通過灌服喂養(yǎng)的方式研究了糞菌移植對不同產(chǎn)蛋水平蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響；宋冰[19]通過一次性注射器從口部緩慢灌入盲腸菌液研究了菌群移植對家兔生產(chǎn)性能、盲腸微生態(tài)和免疫性能的影響；但對于哪種移植方法效果更佳，并未見相關(guān)報道。在豬的糞菌移植途徑中，Hu等[20]綜合考慮生產(chǎn)實際和可操作性，提出了在豬糞菌移植技術(shù)中采用直接灌服或?qū)⒕禾砑佑谌占Z中進行飼喂的建議。

2 糞菌移植技術(shù)的應(yīng)用

2.1 糞菌移植在人類臨床中的應(yīng)用 近年來，隨著對糞菌移植在人類臨床應(yīng)用中的研究的深入，發(fā)現(xiàn)糞菌移植不僅可治療抗生素相關(guān)性腹瀉、難辨梭狀芽孢桿菌感染腸炎等腸道疾病，還可治療自身免疫性疾病等非胃腸道疾病。Meighani等[21]對201例難治性艱難梭菌感染患者進行了FMT，其中20例同時患有炎癥性腸病，發(fā)現(xiàn)FMT治療12周時，炎癥性腸病患者總緩解率為75%。Blanco[22]提出通過FMT改變肥胖癥患者腸道菌群，對于肥胖癥治療具有潛在作用。趙會君等[23]對1名確診孤獨癥5年余的患兒分別經(jīng)胃鏡、腸鏡進行糞微生態(tài)制品注入，治療后8周，患者睡眠障礙、情緒方面有明顯改善，尤其是胃腸道癥狀(呃逆)顯著緩解。Leshem等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在患有心臟代謝綜合征的患者中，腸道微生物菌群會發(fā)生改變，糞菌移植到無菌小鼠體內(nèi)后，其心臟代謝表型也傳遞給無菌小鼠。糞菌移植在人類臨床中的主要應(yīng)用如圖1所示。

圖1 糞便微生物移植在人類臨床上的應(yīng)用

2.2 糞菌移植在畜禽生產(chǎn)中的研究應(yīng)用 糞菌移植在哺乳動物如仔豬、兔，反芻動物如牛、羊，家禽如雞等畜禽的生產(chǎn)研究中均有報道，其研究應(yīng)用如表1所示。

表1 糞菌移植在畜禽生產(chǎn)中的研究應(yīng)用

糞菌移植在畜禽疾病治療中的確切機制尚不清晰，但通過糞菌移植可以使受體腸道菌群得到調(diào)節(jié)，使得有益微生物相對豐度增加、微生物群落多樣性增加、恢復(fù)正常腸道菌群結(jié)構(gòu)[25]；多項研究表明，腸道微生物在維持宿主健康方面發(fā)揮著重要作用，有益的腸道微生物不僅可以調(diào)節(jié)宿主腸道屏障功能還可以代謝產(chǎn)生有益的營養(yǎng)物質(zhì)，而且重要的是這些微生物有助于調(diào)節(jié)局部或全身的免疫功能。有研究表明，糞菌移植可提高大腸埃希菌K88感染仔豬腸道中乳桿菌屬及琥珀酸弧菌屬等有益細(xì)菌的豐度，降低腸桿菌科及變形菌門相對豐度，改善了仔豬腸道形態(tài)，降低了腸道通透性；同時可調(diào)節(jié)仔豬腸道中的支鏈氨基酸、亞油酸代謝；另外，仔豬腸道黏膜中FoxO信號通路中與自噬相關(guān)的蛋白表達(dá)增加，與炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白表達(dá)減少[26]。另有研究表明，糞菌移植可使仔豬結(jié)腸中普雷沃菌、毛螺旋菌科、瘤胃球菌等豐度增加，變形菌門、梭桿菌科、擬桿菌科、大腸埃希菌等有害菌群減少，且仔豬平均增重增加，腹瀉率降低；受體仔豬腸黏膜sIgA+細(xì)胞的光密度、杯狀細(xì)胞的數(shù)量增加，MUC2蛋白的相關(guān)表達(dá)增強；β-防御素2的蛋白表達(dá)及TLR2和TLR4的mRNA表達(dá)明顯升高，表明FMT對受體的生長性能、腸屏障功能和先天免疫及調(diào)節(jié)腸道菌群有重要作用[27]。耿世杰[28]研究表明，糞菌移植可以顯著緩解LPS 誘導(dǎo)的腸上皮損傷，改變腸道菌群功能及其代謝組。唐義梅[29]通過梅山豬糞便微生物移植處理長×大后備母豬，發(fā)現(xiàn)后備母豬的初情日齡提前，血清雌二醇濃度增加，促進了卵泡發(fā)育，并且長×大后備母豬糞便微生物區(qū)系向梅山豬轉(zhuǎn)變。

吳兆海[30]將被動免疫成功犢牛糞菌液移植到被動免疫失敗犢牛瘤胃中，發(fā)現(xiàn)糞菌移植組犢牛結(jié)腸黏膜Claudin-4基因和Occludin基因相對表達(dá)量，空腸Claudin-1蛋白、空腸和結(jié)腸Occludin蛋白表達(dá)量和結(jié)腸ZO-1蛋白表達(dá)量，各腸段黏膜IL-8基因表達(dá)量均顯著高于被動免疫失敗犢牛組；各腸段黏膜TLR-2、空腸黏膜IL-10基因表達(dá)量顯著低于被動免疫失敗犢牛；糞菌移植對被動免疫失敗犢牛生長及健康狀況有良好促進作用。Niederwerder[31]在對包括豬、狗、馬以及家禽等在內(nèi)的十幾種動物利用糞菌移植治療疾病并取得良好效果的基礎(chǔ)上，得出糞菌移植可能是一種未被充分利用、應(yīng)用范圍廣、價格低廉的改善動物健康和動物疾病治療的方法。

3 展望

目前，糞菌移植在人類臨床及畜禽生產(chǎn)中有著廣泛的研究應(yīng)用，同時還有很多需要解決的難題，如糞菌移植供體的選擇、菌液制備、菌液移植途徑、菌液劑量的選擇等，這些過程系統(tǒng)且繁瑣，其操作的復(fù)雜性和專業(yè)性可能制約著它的推廣應(yīng)用。在畜禽生產(chǎn)應(yīng)用中，豬的糞菌移植操作指南已有文獻(xiàn)報道[11]，但在牛、羊等反芻動物中鮮有提及，另外其療效和安全性評估等問題尚未明確。因此，糞菌移植應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)研究時，應(yīng)根據(jù)動物生理特性及需求，謹(jǐn)慎的制定出供體篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇科學(xué)合理的移植途徑，使得糞菌移植過程更加標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，隨后建立科學(xué)的安全評價體系。研究表明，糞便中微生物數(shù)量十分龐大，但目前對它們的認(rèn)知十分有限，其與宿主之間的相互作用機制尚未完全明確，隨著以腸道菌群為靶點的相關(guān)疾病防治的深入研究，針對不同的個體需求或不同疾病，提升糞菌移植的針對性，實現(xiàn)糞菌移植向菌群移植的轉(zhuǎn)變，通過多組學(xué)聯(lián)合分析，探索其防治疾病的機制，可以為糞菌移植治療人類和動物相關(guān)疾病進一步深入研究提供重要指導(dǎo)方向[32]。