在校大學生UCP1基因-3826 A>G位點多態性與體質指數的相關性分析

劉永新，陳 艷，李啟艷，王雨晴，來明名

（大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000）

肥胖已成為全球范圍內常見的醫學社會問題，肥胖會導致許多疾病的患病風險升高，如高血壓、2型糖尿病、心腦血管疾病等〔1-2〕。遺傳學認為肥胖是基因和環境因素共同作用的結果。大量研究表明，大約65%的肥胖是可遺傳的，參與能量消耗或能量攝取的基因可能與肥胖的發生密切相關〔3-4〕。

解偶聯蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）是一種位于線粒體內膜的H+轉運蛋白，能夠將H+運送至線粒體基質，使氧化磷酸化解偶聯不產生三磷酸腺苷，而是轉化為熱能釋放出去〔5〕。UCP1在具有產熱功能的棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）中特異性高表達，主要功能是參與BAT的產熱調節來維持機體的能量代謝平衡〔6〕。在寒冷、腎上腺素或甲狀腺素等刺激下，BAT中的UCP1基因表達增加，從而刺激脂肪組織消耗更多能量來產生熱量。功能研究〔7〕發現，UCP1基因多態性能夠影響UCP1 mRNA表達水平，從而調控能量代謝平衡。UCP1基因-3826 A>G位于上游啟動子區，這個位點的突變與肥胖和代謝紊亂相關聯。-3826 A>G位點突變可導致線粒體氧化磷酸化水平降低，從而引起組織三酰甘油水平增加，高密度脂蛋白水平降低，低密度脂蛋白和膽固醇水平增加〔8〕。但在瑞典和西班牙人中開展的研究則未發現上述關聯〔9-10〕。這種差異可能是由于不同人群的基因背景不同、基因的連鎖不平衡或人群所處的環境不同所導致的。因此，該位點與肥胖之間的相關性仍需要在不同人群中加以驗證。

體質指數（body mass index，BMI）是利用體質量和身高來衡量人的胖瘦程度的一個重要指標。流行病學研究發現，BMI增高與肥胖、高血壓、糖尿病、代謝綜合征等疾病的發生密切相關〔11-12〕。因此，將BMI控制在正常范圍內，有助于對肥胖及其相關代謝綜合征的預防。BMI易受外界因素的影響，如生活習慣、飲食習慣等，但遺傳因素對BMI的影響尚不太清楚。本研究以大理大學在校大學生為研究對象，通過計算個體BMI，檢測UCP1基因-3826 A>G位點多態性，探討該位點多態性與BMI的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本界定及采集從NCBI數據庫中查得UCP1基因-3826 A>G（rs1800592）位點平均突變率為33%，根據現況研究中有限總體的樣本量計算公式〔13〕：n1=z2α/2（1-P）P/δ2，n2=n1N/（N+n1），式中，P=33%為UCP1基因-3826 A>G位點G突變率，δ=5%為允許誤差，zα/2=1.96（α=0.05雙側），N=3 000為研究總體人群數量，計算得調查所需最小樣本量n2=305，最終共收集308例樣本。隨機選取2019年3月—2020年12月大理大學308例在校大學生作為研究對象，采集其口腔黏膜細胞。樣本采集前，告知受試者采樣目的，征得受試者本人知情同意后進行樣本采集并登記其姓名、年齡、身高、體質量及聯系方式。研究遵循的程序符合大理大學醫學倫理委員會制定的倫理學標準并得到批準。

1.2 主要試劑和儀器DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號：DP304）；Master Mix（LGC公司，批號：13116560）；超微量核酸蛋白濃度測定儀（Thermo公司）；高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；實時熒光定量PCR儀（ABI公司）。

1.3 基因組DNA提取清水漱口清理口腔后，用消毒棉簽在受試者口腔內壁刮取黏膜細胞，將取樣棉簽放入裝有500 μL 0.9%氯化鈉溶液的1.5 mL離心管中，振蕩混勻，10 000 r/min離心1 min，獲得口腔黏膜細胞沉淀，使用基因組DNA提取試劑盒，提取基因組DNA。

1.4 UCP1基因-3826 A>G位點多態性分型檢測采用競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）對所提取DNA樣本進行基因分型檢測。根據UCP1基因SNP位點rs1800592（-3826 A>G）設計3條KASP標記引物，包括2條正向特異性引物和1條反向通用引物，引物序列：正向引物（A）：GAAAATGTAGAACACATTAACAAA TGCACTT；正向引物（G）：AAAATGTAGAACACATT AACAAATGCACTC；反向引物：AGCGATTTCTGATT GACCACAGTTTGAT。反應體系10 μL，包括4.78 μL DNA（20～50 ng/μL），5 μL 2×KASP Master Mix，0.14 μL KASP Assay Mix，0.08 μL Mg2+。KASP Assay Mix由3條引物稀釋獲得，按正向引物（A）（100 μmol/L）∶正向引物（G）（100 μmol/L）∶反向引物（100 μmol/L）∶重蒸水=12∶12∶30∶46混合而成。采用降落PCR進行擴增，反應程序：94℃熱處理15 min；94℃變性20 s，61~55℃退火和延伸60 s，10個降落循環（每個循環降低0.6℃）；94℃變性20 s，55℃退火和延伸60 s，26個循環；4℃避光保存。PCR反應在實時熒光定量PCR儀上進行，每次反應設置1個空白對照組，其DNA模板用重蒸水代替，擴增結束后進行基因分型分析。

1.5 BMI計算及分組測量受試者身高、體質量，計算BMI，BMI=體質量（kg）/身高（m）2。根據BMI，將樣本分為體質量過輕（BMI<18.5 kg/m2）、體質量正常（18.5 kg/m2≤BMI<24.0 kg/m2）、體質量過重（24.0 kg/m2≤BMI<28.0 kg/m2）和肥胖（BMI≥28.0 kg/m2）4組。

1.6 統計分析采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析；計數資料以［n（%）］表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UCP1基因-3826 A>G位點多態性分布情況利用KASP技術對UCP1基因-3826 A>G位點多態性進行基因分型檢測，結果見圖1。隨機抽取30份樣本進行一代（Sanger）測序，對KASP檢測結果進行驗證，顯示2種方法的基因分型結果完全一致。見圖2。AA基因型（野生型）64例（占20.8%），AG基因型（雜合變異型）216例（占70.1%），GG基因型（純合變異型）28例（占9.1%），AA、AG和GG基因型頻率分別為：0.21，0.70和0.09。其中，正常A基因頻率為0.56，突變G基因頻率為0.44。

2.2 UCP1基因-3826 A>G位點多態性與不同性別的相關性分析在308例受試者中，年齡18~21歲，男性96例（占31.2%），女性212例（占68.8%），不同性別受試者各基因型構成比差異無統計學意義。見表1。

表1 不同性別受試者3種基因型構成比［n（%）］

2.3 UCP1基因-3826 A>G位點多態性與BMI的相關性分析308例受試者中體質量過輕、體質量正常、體質量過重和肥胖人數所占比例分別為16.9%、79.2%、3.9%和0.0%，其中肥胖人數為0。經統計分析發現，與野生型AA攜帶者BMI（19.60±2.05）kg/m2相比，AG和GG基因型攜帶者BMI分別為（20.52±1.77）kg/m2和（20.95±2.69）kg/m2，顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。對體質量過輕組、體質量正常組和體質量過重組基因型頻率和等位基因頻率進行比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中，純合變異型GG基因型頻率和突變G等位基因頻率在體質量過重組所占比例高于體質量過輕組和體質量正常組。見表2。風險評估顯示，與體質量正常組相比，體質量過重組GG基因型會使體質量增加的風險增高3.875倍，且差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。以上結果表明，BMI較低者UCP1基因突變的頻率較低，而BMI較高者UCP1基因突變的頻率也較高，UCP1基因多態性與BMI存在一定的關聯性，且GG基因型會使體質量增加的風險提高。

表2 UCP1-3826 A>G位點基因型頻率和等位基因頻率在不同人群中的分布［n（%）］

表3 體質量正常組和體質量過重組不同基因型風險評估［n（%）］

3 討論

本研究隨機抽取大理大學在校大學生為研究對象，提取口腔黏膜脫落細胞基因組DNA，通過KASP技術對UCP1基因-3826 A>G位點多態性進行基因分型。研究發現，隨著BMI的增高該位點的突變頻率也逐漸增高，且純合變異型GG會使體質量增加的風險增高3.875倍。結果提示，UCP1基因-3826 A>G位點多態性與BMI、肥胖具有一定的相關性。

UCP1主要位于BAT線粒體內膜上，參與機體的產熱調節和能量代謝，具有抵制肥胖發生的作用〔14〕。因此，UCP1基因表達水平不同會對人體的能量代謝產生重大影響，而肥胖的本質正是由機體能量攝入與消耗的不平衡導致的。Jorge等〔15〕研究發現，UCP1基因突變可以導致脂肪組織UCP1的mRNA表達水平下降，使肥胖的發生風險增加。Sun等〔16〕研究發現，UCP1基因-3826 A>G位點突變會使中國東北漢族人群原發性高血壓的患病風險增加。本研究發現，UCP1基因-3826 A>G位點多態性與體質量、BMI之間存在相關性，純合變異基因型GG在體質量過重組所占比例明顯高于體質量過輕組和體質量正常組，并且突變等位基因G的出現頻率隨著BMI的增加而增高。由于BMI是評價人胖瘦的重要指標之一，本研究結果提示UCP1基因-3826 A>G位點多態性可能會導致肥胖的發生，與Jorge等〔15〕的研究結果類似。有研究〔17-18〕發現，UCP1基因啟動子區域還存在其他位點多態性與疾病易感性相關，例如-1766 A>G和-112 A>C。Kim等〔17〕研究發現，-1766 A>G位點多態性與韓國人群體脂積累有關，突變基因型AG和GG的腰臀比、體脂質量、體脂比例均顯著高于AA型。Fukuyama等〔18〕研究發現，-112 A>C位點突變會引起胰島素抵抗，增加日本人群對2型糖尿病的易感性。然而，這些位點是否會通過相互作用影響疾病的發生目前仍然不是很清楚，這也將是以后研究的一個重點。

本次研究對象為在校大學生，年齡偏小且都是健康人群，在樣本統計時發現，體質量正常的人群所占比例明顯高于體質量過輕或過重人群，肥胖人群在此次隨機選取的樣本中沒有發現，可能會對統計結果有一定的影響。后續將繼續擴大樣本量或選取不同年齡段的人群進一步進行研究，闡明UCP1基因-3826 A>G位點多態性與肥胖之間的關系，有助于人們更深入了解肥胖的發病機制，探索增加能量消耗的減肥新方法，使UCP1成為潛在的重要藥物靶點。