轉基因技術與基因編輯技術在抗除草劑農作物上的應用

崔永禎 楊曉云 李紹祥 浦秋紅 楊忠慧 李宏生 丁明亮，3

（1 云南省農業科學院糧食作物研究所，昆明 650205；2 云南省麗江市種子管理站，麗江 674199；3 中國農業大學植物保護學院植物病理學系/農業農村部作物有害生物監測與綠色防控重點開放實驗室，北京 100193）

自人類對農作物馴化以來，遍布田間的雜草不但與農作物在陽光、水分、養分及生長空間等各種資源上存在一定的競爭，而且還是多種病原菌及害蟲的中間寄主生物，雜草的存在顯著影響農作物的產量及農產品的品質[1]。因此，對各種農作物田間的雜草進行有效地控制可促進農作物的增產增收，是農田管理的重要措施之一。目前，對田間雜草的控制主要有人工拔除、物理除草、化學除草、生物防治除草和微生物除草等，雖然化學除草存在農藥殘留威脅農業生態環境與食品安全，增加農業生產成本及不規范操作帶來的農作物毒害作用等負面效應，但是化學除草仍然是使用最多且效果較好的方式[1-2]。目前，化學除草劑特別是草甘膦和草丁膦等滅生性除草劑由于其高效、低毒、易降解、無殘留等優勢使用廣泛，但這些滅生性除草劑沒有選擇性，不能直接用于各種農作物田間的雜草控制，而通過轉基因技術和基因編輯技術培育抗草甘膦和草丁膦的農作物可以很好地克服這一難題。因此，利用轉基因技術與基因編輯技術培育抗除草劑農作物具有非常廣闊的應用前景，為現代農業的可持續發展提供了可靠保障。

1 轉基因技術研究現狀及其在抗除草劑作物上的應用

1.1 轉基因技術研究現狀轉基因技術（Transgenic technology）是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳并表達出新產物，使其在性狀、功能、表型、營養和消費品質等方面滿足人類需要的技術[3]。轉基因技術與常規雜交育種的區別主要表現在兩個方面：由于不同物種間存在生殖隔離，傳統技術往往僅在物種內的個體上實現基因轉移，而轉基因技術卻不受物種間親緣關系的限制，可打破不同物種間生殖隔離，擴大基因可利用的范圍；由于涉及物種個體間整個基因組的交流，致使傳統的育種技術僅在物種的性狀水平上進行選擇時不可能準確地對某個基因控制的性狀進行選擇，即對后代表現的預見性較差，而轉基因技術中遺傳轉化的基因往往是經過明確定義且功能清晰的基因，即對后代表現的預見性較好。因此，將二者緊密結合，能快速培育多抗、優質、高產、高效新品種，大大提高品種改良效率，并可降低農藥、肥料投入，在緩解資源約束、保障食物安全、保護生態環境、拓展農業功能等方面潛力巨大[4]。

轉基因技術一直是當今生物技術研究的熱點，因此已報道的轉基因技術種類較多，主要分為以下兩類：一類是通過脂質體法、農桿菌或病毒介導的利用表達載體系統轉化的方法；另一類是通過基因槍法、花粉管通道法、Floral dip 法及納米載體包埋法等物理或化學手段直接進行遺傳轉化的方法[3]。在這兩大類遺傳轉化方法中，農桿菌介導的轉基因技術應用最為廣泛，其基本原理是：構建到T-DNA上的目標基因可隨T-DNA 導入植物，進而整合到受體植物的染色體上[5]。該方法具有材料范圍廣、轉化率高、單拷貝比例高、轉化子穩定等特點，歐婷等[6]通過該方法將抗草甘膦基因（EPSPS-G6）導入3 個受體材料，獲得了60 株抗草甘膦轉基因棉花植株，轉化成功率6.4%。

1.2 轉基因技術在抗除草劑農作物上的應用轉基因技術是人類歷史上應用最為迅速的重大技術之一，自20 世紀末轉基因農作物實現商業化種植以來，全世界轉基因農作物的種植面積和銷售效益都得到了飛速發展。國際農業生物技術應用服務組織（ISAAA）發布的《2019 年全球生物技術/轉基因農作物商業化發展態勢》報告顯示：2019 年作為轉基因農作物商業化的第24 年，轉基因農作物在全世界共種植了1.904 億hm2，相比轉基因開始商業化種植起始之年1996 年增加了約112 倍，累計種植面積達27 億hm2；2019 年抗除草劑農作物種植面積為8150 萬hm2（43%），其中抗蟲/抗除草劑（IR/HT）復合性狀農作物面積增長6%，覆蓋了全世界45%的轉基因作物的種植面積，主要涉及大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）、油菜（Brassica campestrisL.）、玉米（Zea maysL.）、苜蓿（Medicago sativaLinn.）和棉花（Gossypium spp.）等農作物[7]。抗除草劑的功能基因主要為PAT（bar）和EPSPS，此外還包括編碼腈水解酶（Nitrilase）的BXN和編碼麥草畏-氧-脫甲基酶（Dicamba O-demethylase）的DDM等[8]。最早實現抗除草劑轉基因農作物商業化種植的國家是美國，目前轉基因農作物的研發機構主要是孟山都、拜耳等種業巨頭[7]。釋放的品種多為單一類型的除草劑抗性轉基因農作物，現在已出現了部分抗蟲/抗除草劑（IR/HT）復合性狀的轉基因農作物[7-8]。

2 基因編輯技術研究現狀及其在抗除草劑作物上的應用

2.1 基因編輯技術研究現狀基因編輯技術是通過對生物體細胞基因組中目的基因的一段核苷酸序列甚至是單個核苷酸進行替換、刪除、增加或者是插入外源的DNA 序列，使之產生可遺傳的、突變的一種生物技術[9-11]。該技術與高能射線或化學誘變劑導致的 DNA 隨機突變不同，基因編輯技術可定向改變基因的組成和結構。當然在自然界生物體對于這種DNA 的變異會自發修復，主要為非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）兩種方式對生物體DNA 損傷進行修復，這也是基因編輯技術的底層邏輯[12]。目前，主流基因編輯技術主要有鋅指核酸酶（ZFNs）、TAL 效應子核酸酶（TALENs）和成簇的規律間隔的短回文重復（CRISPR/Cas9），特別是CRISPR/Cas9 基因編輯技術因其表現出載體構建簡便且不受基因組甲基化影響，能靶向幾乎任意細胞任意序列且可同時靶向多個靶點，切割效率高且精準等突出優勢，發展迅速并獲得了2020年的諾貝爾化學獎[13-14]。CRISPR/Cas9 基因編輯系統的發現始于1987 年，在大腸桿菌的基因組中首次發現了特殊的重復間隔序列，隨后在其他細菌和古細菌中也發現了這一特殊序列，隨后的研究證明CRISPR 系統是古細菌和細菌的一種不斷進化適應的免疫防御機制，直到2012 年CRISPR/Cas9的詳細作用機制被發現，并預測可作為基因編輯技術[15-17]。CRISPR/Cas9 基因編輯技術的原理為：通過人工設計的gRNA（guide RNA）來識別目的基因組序列，并引導Cas9 蛋白進行有效切割DNA 雙鏈，形成雙鏈斷裂，損傷后修復會造成堿基敲除或插入等[18]。在CRISPR/Cas 系統中，依據Cas 蛋白的種類及其組合的不同可分為Type Ⅰ、Type Ⅱ和 Type Ⅲ 3 種主要類型，其中Type Ⅰ類型含有Cas1、Cas2 和Cas3，Type Ⅱ類型含有Cas1、Cas2和Cas9，Type Ⅲ類型含有Cas1、Cas2 和Cas10，由于Type Ⅱ免疫系統需要的Cas 蛋白相對簡單，因此經過人為改造的Type Ⅱ類型的CRISPR/Cas9 系統已成為一個高效、簡便的基因編輯工具[19]。隨著技術的進步，CRISPR/Cas9 基因編輯技術得到了一定的發展。David Liu 團隊改造了CRISPR/Cas9 基因編輯系統，研發出首個可編輯DNA 單個堿基的基因編輯技術CBE（Cytosine base editor），可以將C-G 堿基對轉變成 T-A 堿基對[20]；之后該團隊又獲得可將 A-T 堿基對轉變成 G-C 堿基對的堿基編輯器ABE（Adenine base editor），同時具有較低的編輯錯誤發生率[21]。在2019 年該團隊實現了基因編輯領域的里程碑式突破，開發出一種超精確的新型基因編輯工具PE（Prime editors），無需DNA 雙鏈斷裂，無需額外的DNA 模板，便可實現ATCG 4 種堿基間所有12 種單堿基的自由“改變”，并且能有效實現多堿基的精準增刪[22]。在國內，研究者開發了“循環打靶”堿基編輯策略，通過雙靶點的“循環打靶”設計將CRISPR/Cas9 變成了全功能的堿基編輯器，隨后又設計了能夠上調基因表達的倒位、重復等基因組結構變異，成功實現了對目標基因的敲高[23-24]。CRISPR/Cas9 基因編輯技術的出現與發展很大程度上促進了整個生命科學的發展，不僅用于藥物開發、疾病治療、基因調控等領域的研究，而且在農作物的遺傳改良如抗除草劑作物的培育等領域也起到重要作用[9]。

2.2 基因編輯技術在抗除草劑農作物上的應用基因編輯技術相比傳統育種技術能快速定向改良農作物的目標性狀，并且可大大縮短育種周期，當前利用主流的CRISPR/Cas9 基因編輯技術對農作物的產量、品質、抗逆性、抗蟲及抗除草劑等方面進行改良獲得了較好的效果[10-11]。迄今為止，通過基因組編輯技術已經開發了多個抗除草劑作物，可以很好地解決雜草問題和提高作物生產力，以滿足世界各地日益增長的糧食需求并發揮重要作用[11]。Svitashev 等[25]采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術編輯玉米ALS2基因獲得了抗除草劑氯磺隆的玉米突變種質。Chen 等[26]利用基于CRISPR/Cas9 基因編輯技術的“循環打靶”堿基編輯策略將Cas9 變成了全功能的堿基編輯器，在被成功編輯的水稻植株中，利用高表達基因CP12基因的啟動子驅動PPO1基因的表達和高表達基因Ubiquitin2基因的啟動子驅動HPPD基因的表達，從而大幅“敲高”了水稻內源PPO1和HPPD基因，使水稻植株表現出預期的抗除草劑性狀。Zhang 等[27]利用基于CRISPR/Cas9 系統的單堿基編輯技術，對高產小麥品種科農199 乙酰乳酸合成酶（ALS）基因進行編輯，獲得了抗除草劑煙嘧磺隆（Nicosulfuron）的小麥基因編輯種質。除以上農作物以外，通過基因編輯技術也獲得了土豆（Solanum tuberosumL.）、大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）、油菜（Brassica campestrisL.）、西瓜（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.et Nakai）、番茄（Lycopersicon esculentumMiller）、亞麻（Linum usitatissimumL.）、辣椒（Capsicum annuumL.）和木薯（Manihot esculentaCrantz）等農作物的抗除草劑新種質[11]。

3 展望

轉基因技術和基因編輯技術已廣泛應用于抗除草劑農作物的改良，也取得了較好的效果。由于公眾普遍認為轉基因作物可能存在一定的環境和公共衛生風險，因此轉基因農作物特別是糧食作物的種植在一些國家仍然受到限制。然而，基因編輯技術被普遍認為屬于非轉基因范疇，可切實打消公眾對于轉基因農作物的顧慮[11]。2015 年第1 個基因編輯抗除草劑農作物油菜作為非轉基因農作物被批準在美國種植，標志著基于基因編輯的抗除草劑農作物在農業生產上實現了商業化應用[26]。當前，我國轉基因技術與基因編輯技術等先進農業生物技術的某些領域已處于國際領先水平，但整體實力與國際先進水平還有一定的距離，應繼續尋求技術創新，切實推動包括抗除草劑農作物品種改良在內相關農業生物技術的發展，以促進我國現代化農業的可持續發展。因此，利用轉基因技術與基因編輯技術培育的抗除草劑農作物特別是糧食作物具有非常廣闊的應用前景。