轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因編輯技術(shù)在抗除草劑農(nóng)作物上的應(yīng)用

崔永禎 楊曉云 李紹祥 浦秋紅 楊忠慧 李宏生 丁明亮，3

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，昆明 650205；2 云南省麗江市種子管理站，麗江 674199；3 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物有害生物監(jiān)測(cè)與綠色防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

自人類對(duì)農(nóng)作物馴化以來，遍布田間的雜草不但與農(nóng)作物在陽光、水分、養(yǎng)分及生長空間等各種資源上存在一定的競(jìng)爭(zhēng)，而且還是多種病原菌及害蟲的中間寄主生物，雜草的存在顯著影響農(nóng)作物的產(chǎn)量及農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)[1]。因此，對(duì)各種農(nóng)作物田間的雜草進(jìn)行有效地控制可促進(jìn)農(nóng)作物的增產(chǎn)增收，是農(nóng)田管理的重要措施之一。目前，對(duì)田間雜草的控制主要有人工拔除、物理除草、化學(xué)除草、生物防治除草和微生物除草等，雖然化學(xué)除草存在農(nóng)藥殘留威脅農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境與食品安全，增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本及不規(guī)范操作帶來的農(nóng)作物毒害作用等負(fù)面效應(yīng)，但是化學(xué)除草仍然是使用最多且效果較好的方式[1-2]。目前，化學(xué)除草劑特別是草甘膦和草丁膦等滅生性除草劑由于其高效、低毒、易降解、無殘留等優(yōu)勢(shì)使用廣泛，但這些滅生性除草劑沒有選擇性，不能直接用于各種農(nóng)作物田間的雜草控制，而通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)培育抗草甘膦和草丁膦的農(nóng)作物可以很好地克服這一難題。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因編輯技術(shù)培育抗除草劑農(nóng)作物具有非常廣闊的應(yīng)用前景，為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了可靠保障。

1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究現(xiàn)狀及其在抗除草劑作物上的應(yīng)用

1.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenic technology）是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物，使其在性狀、功能、表型、營養(yǎng)和消費(fèi)品質(zhì)等方面滿足人類需要的技術(shù)[3]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)雜交育種的區(qū)別主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：由于不同物種間存在生殖隔離，傳統(tǒng)技術(shù)往往僅在物種內(nèi)的個(gè)體上實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)卻不受物種間親緣關(guān)系的限制，可打破不同物種間生殖隔離，擴(kuò)大基因可利用的范圍；由于涉及物種個(gè)體間整個(gè)基因組的交流，致使傳統(tǒng)的育種技術(shù)僅在物種的性狀水平上進(jìn)行選擇時(shí)不可能準(zhǔn)確地對(duì)某個(gè)基因控制的性狀進(jìn)行選擇，即對(duì)后代表現(xiàn)的預(yù)見性較差，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)中遺傳轉(zhuǎn)化的基因往往是經(jīng)過明確定義且功能清晰的基因，即對(duì)后代表現(xiàn)的預(yù)見性較好。因此，將二者緊密結(jié)合，能快速培育多抗、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效新品種，大大提高品種改良效率，并可降低農(nóng)藥、肥料投入，在緩解資源約束、保障食物安全、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、拓展農(nóng)業(yè)功能等方面潛力巨大[4]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)一直是當(dāng)今生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)，因此已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因技術(shù)種類較多，主要分為以下兩類：一類是通過脂質(zhì)體法、農(nóng)桿菌或病毒介導(dǎo)的利用表達(dá)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的方法；另一類是通過基因槍法、花粉管通道法、Floral dip 法及納米載體包埋法等物理或化學(xué)手段直接進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的方法[3]。在這兩大類遺傳轉(zhuǎn)化方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，其基本原理是：構(gòu)建到T-DNA上的目標(biāo)基因可隨T-DNA 導(dǎo)入植物，進(jìn)而整合到受體植物的染色體上[5]。該方法具有材料范圍廣、轉(zhuǎn)化率高、單拷貝比例高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定等特點(diǎn)，歐婷等[6]通過該方法將抗草甘膦基因（EPSPS-G6）導(dǎo)入3 個(gè)受體材料，獲得了60 株抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花植株，轉(zhuǎn)化成功率6.4%。

1.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在抗除草劑農(nóng)作物上的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)是人類歷史上應(yīng)用最為迅速的重大技術(shù)之一，自20 世紀(jì)末轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物實(shí)現(xiàn)商業(yè)化種植以來，全世界轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的種植面積和銷售效益都得到了飛速發(fā)展。國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）發(fā)布的《2019 年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)》報(bào)告顯示：2019 年作為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化的第24 年，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在全世界共種植了1.904 億hm2，相比轉(zhuǎn)基因開始商業(yè)化種植起始之年1996 年增加了約112 倍，累計(jì)種植面積達(dá)27 億hm2；2019 年抗除草劑農(nóng)作物種植面積為8150 萬hm2（43%），其中抗蟲/抗除草劑（IR/HT）復(fù)合性狀農(nóng)作物面積增長6%，覆蓋了全世界45%的轉(zhuǎn)基因作物的種植面積，主要涉及大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）、油菜（Brassica campestrisL.）、玉米（Zea maysL.）、苜蓿（Medicago sativaLinn.）和棉花（Gossypium spp.）等農(nóng)作物[7]。抗除草劑的功能基因主要為PAT（bar）和EPSPS，此外還包括編碼腈水解酶（Nitrilase）的BXN和編碼麥草畏-氧-脫甲基酶（Dicamba O-demethylase）的DDM等[8]。最早實(shí)現(xiàn)抗除草劑轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化種植的國家是美國，目前轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的研發(fā)機(jī)構(gòu)主要是孟山都、拜耳等種業(yè)巨頭[7]。釋放的品種多為單一類型的除草劑抗性轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，現(xiàn)在已出現(xiàn)了部分抗蟲/抗除草劑（IR/HT）復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物[7-8]。

2 基因編輯技術(shù)研究現(xiàn)狀及其在抗除草劑作物上的應(yīng)用

2.1 基因編輯技術(shù)研究現(xiàn)狀基因編輯技術(shù)是通過對(duì)生物體細(xì)胞基因組中目的基因的一段核苷酸序列甚至是單個(gè)核苷酸進(jìn)行替換、刪除、增加或者是插入外源的DNA 序列，使之產(chǎn)生可遺傳的、突變的一種生物技術(shù)[9-11]。該技術(shù)與高能射線或化學(xué)誘變劑導(dǎo)致的 DNA 隨機(jī)突變不同，基因編輯技術(shù)可定向改變基因的組成和結(jié)構(gòu)。當(dāng)然在自然界生物體對(duì)于這種DNA 的變異會(huì)自發(fā)修復(fù)，主要為非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）兩種方式對(duì)生物體DNA 損傷進(jìn)行修復(fù)，這也是基因編輯技術(shù)的底層邏輯[12]。目前，主流基因編輯技術(shù)主要有鋅指核酸酶（ZFNs）、TAL 效應(yīng)子核酸酶（TALENs）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)（CRISPR/Cas9），特別是CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)因其表現(xiàn)出載體構(gòu)建簡(jiǎn)便且不受基因組甲基化影響，能靶向幾乎任意細(xì)胞任意序列且可同時(shí)靶向多個(gè)靶點(diǎn)，切割效率高且精準(zhǔn)等突出優(yōu)勢(shì)，發(fā)展迅速并獲得了2020年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[13-14]。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)始于1987 年，在大腸桿菌的基因組中首次發(fā)現(xiàn)了特殊的重復(fù)間隔序列，隨后在其他細(xì)菌和古細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了這一特殊序列，隨后的研究證明CRISPR 系統(tǒng)是古細(xì)菌和細(xì)菌的一種不斷進(jìn)化適應(yīng)的免疫防御機(jī)制，直到2012 年CRISPR/Cas9的詳細(xì)作用機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，并預(yù)測(cè)可作為基因編輯技術(shù)[15-17]。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的原理為：通過人工設(shè)計(jì)的gRNA（guide RNA）來識(shí)別目的基因組序列，并引導(dǎo)Cas9 蛋白進(jìn)行有效切割DNA 雙鏈，形成雙鏈斷裂，損傷后修復(fù)會(huì)造成堿基敲除或插入等[18]。在CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，依據(jù)Cas 蛋白的種類及其組合的不同可分為Type Ⅰ、Type Ⅱ和 Type Ⅲ 3 種主要類型，其中Type Ⅰ類型含有Cas1、Cas2 和Cas3，Type Ⅱ類型含有Cas1、Cas2和Cas9，Type Ⅲ類型含有Cas1、Cas2 和Cas10，由于Type Ⅱ免疫系統(tǒng)需要的Cas 蛋白相對(duì)簡(jiǎn)單，因此經(jīng)過人為改造的Type Ⅱ類型的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已成為一個(gè)高效、簡(jiǎn)便的基因編輯工具[19]。隨著技術(shù)的進(jìn)步，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)得到了一定的發(fā)展。David Liu 團(tuán)隊(duì)改造了CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)，研發(fā)出首個(gè)可編輯DNA 單個(gè)堿基的基因編輯技術(shù)CBE（Cytosine base editor），可以將C-G 堿基對(duì)轉(zhuǎn)變成 T-A 堿基對(duì)[20]；之后該團(tuán)隊(duì)又獲得可將 A-T 堿基對(duì)轉(zhuǎn)變成 G-C 堿基對(duì)的堿基編輯器ABE（Adenine base editor），同時(shí)具有較低的編輯錯(cuò)誤發(fā)生率[21]。在2019 年該團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了基因編輯領(lǐng)域的里程碑式突破，開發(fā)出一種超精確的新型基因編輯工具PE（Prime editors），無需DNA 雙鏈斷裂，無需額外的DNA 模板，便可實(shí)現(xiàn)ATCG 4 種堿基間所有12 種單堿基的自由“改變”，并且能有效實(shí)現(xiàn)多堿基的精準(zhǔn)增刪[22]。在國內(nèi)，研究者開發(fā)了“循環(huán)打靶”堿基編輯策略，通過雙靶點(diǎn)的“循環(huán)打靶”設(shè)計(jì)將CRISPR/Cas9 變成了全功能的堿基編輯器，隨后又設(shè)計(jì)了能夠上調(diào)基因表達(dá)的倒位、重復(fù)等基因組結(jié)構(gòu)變異，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)基因的敲高[23-24]。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展很大程度上促進(jìn)了整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展，不僅用于藥物開發(fā)、疾病治療、基因調(diào)控等領(lǐng)域的研究，而且在農(nóng)作物的遺傳改良如抗除草劑作物的培育等領(lǐng)域也起到重要作用[9]。

2.2 基因編輯技術(shù)在抗除草劑農(nóng)作物上的應(yīng)用基因編輯技術(shù)相比傳統(tǒng)育種技術(shù)能快速定向改良農(nóng)作物的目標(biāo)性狀，并且可大大縮短育種周期，當(dāng)前利用主流的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對(duì)農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性、抗蟲及抗除草劑等方面進(jìn)行改良獲得了較好的效果[10-11]。迄今為止，通過基因組編輯技術(shù)已經(jīng)開發(fā)了多個(gè)抗除草劑作物，可以很好地解決雜草問題和提高作物生產(chǎn)力，以滿足世界各地日益增長的糧食需求并發(fā)揮重要作用[11]。Svitashev 等[25]采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)編輯玉米ALS2基因獲得了抗除草劑氯磺隆的玉米突變種質(zhì)。Chen 等[26]利用基于CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的“循環(huán)打靶”堿基編輯策略將Cas9 變成了全功能的堿基編輯器，在被成功編輯的水稻植株中，利用高表達(dá)基因CP12基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)PPO1基因的表達(dá)和高表達(dá)基因Ubiquitin2基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)HPPD基因的表達(dá)，從而大幅“敲高”了水稻內(nèi)源PPO1和HPPD基因，使水稻植株表現(xiàn)出預(yù)期的抗除草劑性狀。Zhang 等[27]利用基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的單堿基編輯技術(shù)，對(duì)高產(chǎn)小麥品種科農(nóng)199 乙酰乳酸合成酶（ALS）基因進(jìn)行編輯，獲得了抗除草劑煙嘧磺隆（Nicosulfuron）的小麥基因編輯種質(zhì)。除以上農(nóng)作物以外，通過基因編輯技術(shù)也獲得了土豆（Solanum tuberosumL.）、大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）、油菜（Brassica campestrisL.）、西瓜（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.et Nakai）、番茄（Lycopersicon esculentumMiller）、亞麻（Linum usitatissimumL.）、辣椒（Capsicum annuumL.）和木薯（Manihot esculentaCrantz）等農(nóng)作物的抗除草劑新種質(zhì)[11]。

3 展望

轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于抗除草劑農(nóng)作物的改良，也取得了較好的效果。由于公眾普遍認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物可能存在一定的環(huán)境和公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)，因此轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物特別是糧食作物的種植在一些國家仍然受到限制。然而，基因編輯技術(shù)被普遍認(rèn)為屬于非轉(zhuǎn)基因范疇，可切實(shí)打消公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的顧慮[11]。2015 年第1 個(gè)基因編輯抗除草劑農(nóng)作物油菜作為非轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物被批準(zhǔn)在美國種植，標(biāo)志著基于基因編輯的抗除草劑農(nóng)作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化應(yīng)用[26]。當(dāng)前，我國轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因編輯技術(shù)等先進(jìn)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的某些領(lǐng)域已處于國際領(lǐng)先水平，但整體實(shí)力與國際先進(jìn)水平還有一定的距離，應(yīng)繼續(xù)尋求技術(shù)創(chuàng)新，切實(shí)推動(dòng)包括抗除草劑農(nóng)作物品種改良在內(nèi)相關(guān)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展，以促進(jìn)我國現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因編輯技術(shù)培育的抗除草劑農(nóng)作物特別是糧食作物具有非常廣闊的應(yīng)用前景。