遠隔缺血預處理上調線粒體自噬減輕小鼠急性腎缺血再灌注損傷

李軼男，裴漢軍，余學文

內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院，內蒙古 包頭 014010

0 引言

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是常見嚴重的臨床疾病，除對患者自身產生危害外，其高發病率也給醫療保健系統帶來了巨大挑戰[1]。許多學者指出AKI的發生、發展與線粒體自噬水平的高低密切相關[2-3]，線粒體自噬水平的增加可作為腎小管細胞在應激條件下的一種保護機制[4]。因此如何有效調控線粒體自噬水平、進而改善腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）已成為現階段臨床研究的重點及熱點[5]。遠隔缺血預處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）是通過對器官或組織進行短暫、可逆的缺血再灌注處理，使靶器官能夠抵抗氧化應激和致死性IRI的方法[6]。有研究[7]發現RIPC可誘導對腎臟IRI產生保護作用。因缺血再灌注是引起AKI的主要原因，故本實驗構建急性腎IRI模型，進一步驗證RIPC在AKI中的保護作用，并從線粒體自噬角度分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

研究所用24只雄性C57BL/6小鼠購買于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。飼養在包頭醫學院動物房內，飼養條件：光暗循環12h、通風良好、溫度21℃～25℃。定期更換墊料、喂食標準鼠糧及自來水。本研究的所有程序均獲得內蒙古科技大學包頭醫學院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 分組方法

將C57BL/6小鼠8～10周（體重20～25g）隨機分為4組，每組6只。

（1）假手術組（Sham）：沿脊柱兩旁腎區部位切開，暴露兩側腎臟，不做任何處理，維持1h后縫合創口，正常飼養23h。

（2）缺血再灌注（I/R）：暴露兩側腎臟，微型動脈夾夾閉雙側腎蒂，夾閉40min，再灌注1h后縫合創口，正常飼養23h。

（3）遠隔缺血預處理組（RIPC）：橡皮筋結扎小鼠左后肢根部，缺血5min，再灌注5min，反復4個循環，之后的操作同I/R組。

（4）自噬抑制劑組（RIPC+3-MA）：在RIPC處理的基礎上，經腹腔注射3-MA（30mg/kg，0.2mL/20g體重），2h后所有操作按I/R組進行。

1.2.2 模型制備

（1）IRI模型：用10%的水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉，待夾尾反射消失后，沿脊柱兩旁腎區部位切開暴露腎臟，微型動脈夾夾閉雙側腎蒂40min，再灌注24h，構建IRI模型。

（2）RIPC模型：用10%的水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉，待夾尾反射消失后，用橡皮筋結扎小鼠左后肢根部，缺血5min，再灌注5min，反復4個循環，之后的操作同I/R組。

1.3 觀察指標

1.3.1 血肌酐、尿素氮測定

使用全自動生化分析儀（美國雅培C16000），檢測每組小鼠血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）濃度。

1.3.2 HE染色后觀察腎小管損傷程度

HE染色法：石蠟切片經烤片、脫蠟、水化后，用蘇木素、伊紅染色，脫水、透明后觀察。在腎皮質和髓質結合部及外髓采集10個連續視野，進行盲法半定量評分：無損傷（0分）、輕度損傷（＜25%，1分）、中度損傷（25%～50%，2分）、重度損傷（損傷面積51%～75%，3分）、極重度損傷（＞75%，記4分）。

1.3.3 線粒體自噬情況

免疫印跡法：取腎臟皮質和髓質交界區組織，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，隨后經電泳、轉膜、封閉、一抗（LC3A/B、Beclin1）4℃過夜孵育、二抗孵育、顯色等步驟，觀察LC3A/B、Beclin1的表達。

免疫組織化學法：將制備好的石蠟切片經脫蠟和水化、抗原修復、內源性過氧化物酶阻斷劑孵育、一抗（p62）4℃過夜孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片等步驟后，在顯微鏡下觀察p62的表達情況。

免疫熒光雙標法：將制備好的石蠟切片經脫蠟和水化、抗原修復、3%雙氧水孵育、5%BSA封閉、一抗混合工作液（TOMM20、LAMP2、LC3A/B）4℃過夜孵育、熒光二抗混合工作液（山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗1）37℃避光孵育、DAPI染色、水溶性封片劑封片等步驟后，在熒光顯微鏡下觀察其定位情況。

1.4 統計學方法

用SPSS 23.0軟件對實驗數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnetts T3檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組小鼠血Scr、BUN水平比較

與Sham組比較，其余各組Scr、BUN濃度均增加（P＜0.05）。與I/R組比較，RIPC組Scr、BUN濃度均降低（P＜0.05）。與RIPC組相比，RIPC+3-MA組Scr、BUN濃度增加（P＜0.05），見表1。

表1 三組小鼠SCr、BUN 比較（）

表1 三組小鼠SCr、BUN 比較（）

注：*P＜0.05vs Sham group；#P＜0.05vs I/R group；△P＜0.05vs RIPC group。

2.2 四組小鼠腎小管損傷情況比較

與Sham組比較，其余各組腎小管損傷半定量損傷評分均增加（P＜0.05），與I/R組比較，RIPC組腎小管損傷半定量評分降低（P＜0.05）。與RIPC組相比，RIPC+3-MA組腎小管損傷半定量評分增加（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組腎組織腎小管損傷半定量評分比較

2.3 四組小鼠線粒體自噬情況比較

免疫印跡法示：與Sham組相比，I/R組、RIPC組LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白的表達水平明顯增加（P＜0.05）。與I/R組相比，RIPC組LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白的表達水平增加（P＜0.05）。與RIPC組相比，RIPC+3-MA組LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白的表達水平減低（P＜0.05），見圖2。

圖2 免疫印跡法檢測各組腎組織LC3A/B、Beclin1 蛋白半定量分析

免疫組化示：與Sham組相比，其余三組p62蛋白的光密度值降低（P＜0.05）。與I/R組相比，RIPC組p62蛋白的光密度值降低（P＜0.05）。與RIPC+3-MA組相比，RIPC組p62蛋白的光密度值降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 免疫組織化學法各組腎組織p62 蛋白平均光密度值比較

免疫熒光雙標共定位結果示：與Sham組相比，各組腎組織線粒體外膜轉位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）與LC3A/B、TOMM20與溶酶體相關膜蛋白2（lysosome-associated membrane protein-2，LAMP2）共定位面積百分比明顯增加（P＜0.05）。與I/R組相比，RIPC組腎組織TOMM20和LC3A/B及TOMM20和LAMP2共定位面積百分比增加（P＜0.05）。與RIPC組相比，RIPC+3-MA組腎組織TOMM20和LC3A/B及TOMM20和LAMP2共定位面積百分比降低（P＜0.05），見圖4、圖5。

圖4 免疫熒光雙標各組腎組織TOMM20 與LC3A/B 共定位面積百分比比較

圖5 免疫熒光雙標各組腎組織TOMM20 與LAMP2 共定位面積百分比比較

3 討論

目前臨床尚缺乏預防AKI的有效方法。RIPC是在致傷因素作用于靶器官之前，通過對遠隔組織（如四肢動脈）或器官血供短暫阻斷后恢復灌注，以期保護靶器官的治療方法。該技術最早被用于減輕心肌組織的缺血再灌注損傷，其可減小由冠狀動脈長時間閉塞導致的心肌梗死的面積[8]。隨后的研究發現RIPC的保護作用同樣存在于除心臟之外的其他器官，例如腎臟[9]，但RIPC對腎功能保護作用的具體機制尚未闡明。

線粒體自噬是通過自噬途徑選擇性降解過量或缺陷的線粒體，是線粒體質量控制的核心及細胞內維持穩態的必要條件[10]。不同途徑介導的線粒體自噬作為腎臟的保護機制被激活，在應激條件下，線粒體自噬可以作為一種防御性或適應性機制被誘導，來維持健康的線粒體群體，以促進細胞存活[11]。線粒體自噬水平的不足和下降與AKI的發生、進展密切相關。

本研究結果顯示：通過對IRI模型小鼠行RIPC后，小鼠Scr、BUN濃度明顯下降，腎小管損傷半定量評分減低，說明RIPC可以減輕腎IRI。Beclin1、LC3A/B、p62均是參與線粒體自噬的關鍵分子。有研究[12]指出Beclin1是自噬啟動的關鍵分子，Beclin-1/（VPS34）/VPS15/Atg14復合物可促使自噬囊泡成核；LC3-I與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-II，介導吞噬泡的生長和閉合形成自噬體；p62是自噬的選擇性底物，在自噬過程中，它通過LC3相互作用區與LC3結合，依靠自噬溶酶體途徑促使泛素化的線粒體在溶酶體內降解，同時其自身也被降解。因此p62蛋白含量的降低，以及Beclin1含量的增加和LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化可作為線粒體自噬激活的標志。此外，我們用TOMM20分別與LC3A/B及LAMP2進行免疫熒光雙標共定位，標記線粒體自噬體和線粒體自噬溶酶體，描述線粒體自噬水平在早期和中期的變化，使線粒體自噬可視化。本研究通過對四組小鼠的線粒體自噬水平進行綜合評估后發現，與I/R組相比，RIPC組LC3A/BⅡ/LC3A/BⅠ、Beclin1蛋白表達水平增高，p62蛋白光密度值降低，TOMM20與LC3A/B、TOMM20與LAMP2熒光共定位面積百分比增加，說明RIPC可以上調線粒體自噬水平。給予自噬抑制劑后，線粒體自噬水平降低且RIPC的腎保護作用被逆轉，進一步支持RIPC可誘導線粒體自噬減輕腎IRI。

綜上所述，RIPC可減輕小鼠急性腎IRI，其機制與激活線粒體自噬有關，為減輕AKI提供了新思路。