梨組織培養(yǎng)研究進(jìn)展及其在育種中的應(yīng)用*

葉 宇，歐春青，王 斐，張艷杰，馬 力，楊冠宇，李佳純，姜淑苓

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，遼寧興城 125100）

梨為薔薇科（Rosacea）蘋(píng)果亞科（Maloideae）梨屬（PyrusL.）多年生木本植物，是世界性的重要落葉果樹(shù)。《中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒（2021）》[1]統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)2020 年的梨產(chǎn)量為1 781.5 萬(wàn)t，在我國(guó)水果產(chǎn)量中排在第3 位，僅次于柑橘、蘋(píng)果。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）最新數(shù)據(jù)，目前中國(guó)梨栽培面積、產(chǎn)量以及出口量均居世界首位。采用組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)，不僅可以對(duì)母本的優(yōu)良性狀進(jìn)行保存、提純和復(fù)壯，而且還能夠消除季節(jié)因素的限制，從而顯著地提高繁殖系數(shù)，為遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)，創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文就國(guó)內(nèi)外有關(guān)梨組織培養(yǎng)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為今后的梨組培研究提供參考。

1 梨組織培養(yǎng)的外植體

植物組織培養(yǎng)技術(shù)起源于1902 年德國(guó)植物學(xué)家哈伯蘭特提出的植物細(xì)胞具有全能性的概念[2]。梨組織培養(yǎng)的研究始于20 世紀(jì)30 年代，70 年代后關(guān)于梨及其砧木的組織培養(yǎng)的報(bào)道才逐漸增多，并且開(kāi)始進(jìn)行商業(yè)性生產(chǎn)[3]。目前，梨的組織培養(yǎng)工作已經(jīng)取得了不少成果，根據(jù)培養(yǎng)的目的不同而采用不同的外植體，國(guó)內(nèi)外研究人員已對(duì)莖尖、莖段、葉片、子葉、花藥、原生質(zhì)體等外植體成功進(jìn)行了培養(yǎng)，其中葉片培養(yǎng)和莖尖培養(yǎng)的相關(guān)研究較多[4]。

1.1 外植體選擇

梨樹(shù)的不同組織或器官都可作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，但不同的外植體的再生能力不同，因此，選擇合適的外植體是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。

葉片是梨遺傳轉(zhuǎn)化中普遍采用的外植體。葉片再生方式有間接再生和直接再生，大多數(shù)梨品種的葉片再生方式是間接再生，即從葉片愈傷組織產(chǎn)生不定芽。最早于1988 年，Laimer 等[5]用西洋梨康弗倫斯試管苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織形成球狀結(jié)構(gòu)，但是效果不佳，僅有少量球狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成不定梢。隨后Abu-Qaoud 等[6]于1991 年在改變氮源比例的條件下，證明了氮素對(duì)梨葉片外植體的不定芽再生是至關(guān)重要的。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)葉片組織培養(yǎng)的研究也獲得了一些成果，鐘穎等[7]通過(guò)篩選不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合以及附加不同質(zhì)量濃度的硝酸銀（AgNO3）建立了庫(kù)爾勒香梨的再生體系，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%，不定芽形成率84.92%。王月等[8]對(duì)梨矮化砧木青砧D3 葉片進(jìn)行了高效再生體系的構(gòu)建，不定芽再生率達(dá)100%，根誘導(dǎo)率達(dá)100%。迄今為止，雪花梨[9]、秋子梨[10]、南果梨[11]、蘋(píng)果梨[12]、西洋梨紅星[13]等均已建立葉片再生體系。

莖尖屬于分生組織，分裂最為活躍，幾乎不含病毒，莖尖培養(yǎng)的主要目的是脫除病毒和快速繁殖。梨病毒已報(bào)道的有20 余種，發(fā)生較普遍的有蘋(píng)果莖痘病毒（ASPV）、蘋(píng)果莖溝病毒（ASGV）和蘋(píng)果褪綠葉斑病毒（ACLSV）等[14]。所以，實(shí)行苗木脫毒對(duì)果品生產(chǎn)具有重要意義。早在1979 年Lane[15]首次對(duì)梨的莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)，并獲得了完整的植株。隨后國(guó)內(nèi)學(xué)者趙惠祥[16]于1982 年以錦豐和早酥實(shí)生苗的莖尖為外植體培養(yǎng)獲得植株。苗冉冉等[17]以津香蜜和巴梨的新梢為材料，建立了組培快繁體系，增殖系數(shù)達(dá)到5.73 和3.83。王勝男等[18]對(duì)京白梨的莖尖離體培養(yǎng)進(jìn)行了研究，摸索出了最佳的增殖和生根培養(yǎng)基配方。到目前為止，莖尖培養(yǎng)已在黃冠梨[19]、庫(kù)爾勒香梨[20]、早酥[21]、中香梨[22]、南果梨[23]等品種上獲得了成功。

莖段、芽等器官也可作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。莖段培養(yǎng)可以分為有芽莖段培養(yǎng)和無(wú)芽莖段培養(yǎng)，相比于無(wú)芽莖段培養(yǎng)，有芽莖段培養(yǎng)更容易成功。孫清榮等[24]以西洋梨紅茄的有芽莖段為外植體，進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)萌發(fā)，成功獲得了無(wú)菌苗。劉春等[3]在對(duì)京白梨花芽進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)1/2MS 比MS 更有利于愈傷組織的分化，但出芽率較低，并且篩選出了1.5 mg/L GA3對(duì)花芽愈傷組織誘導(dǎo)具有積極作用，45 d 后分化出完整植株。

目前，梨組織培養(yǎng)主要以葉片和莖尖為外植體材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過(guò)不同培養(yǎng)途徑獲得再生植株。另外，也有部分研究通過(guò)培養(yǎng)子葉、花粉、胚、原生質(zhì)體等得到了再生植株[25-28]。通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)以器官直接誘導(dǎo)和誘導(dǎo)愈傷組織形成的再生植株，再生率較高。

1.2 外植體滅菌

外植體的消毒滅菌工作是植物組織培養(yǎng)技術(shù)中關(guān)鍵的一步。梨在生長(zhǎng)過(guò)程中常年暴露在外界環(huán)境中，頂芽、莖和葉等器官容易附生或共生多種微生物。應(yīng)用科學(xué)的滅菌方式能夠消滅外植體表面的細(xì)菌和真菌，在降低褐變率的同時(shí)，最大程度地減少外植體本身攜帶的污染保證成活率。

一般先將外植體用洗衣粉或洗潔精浸泡30 min，再用流水沖洗1 h 以上，在超凈工作臺(tái)上采用75%乙醇（C2H5OH）消毒30 s，無(wú)菌水沖洗3～5次，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒3～10 min，無(wú)菌水沖洗3～5 次[17,20,29]；或者2%～5%次氯酸鈉（NaClO）消毒8～15 min，無(wú)菌水沖洗5～6 次，取出置于無(wú)菌吸水紙上吸去其表面多余水分[13,18]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，相比于次氯酸鈉，升汞的消毒效果較好。劉春等[3]對(duì)京白梨芽采用2%次氯酸鈉和0.1%升汞溶液進(jìn)行消毒處理，結(jié)果表明前者污染率為33%，后者污染率為18%。然而，由于升汞的劇毒性質(zhì)，不利于試驗(yàn)操作和廢液處理，對(duì)人體也有較大危害。Arab 等[30]對(duì)于G×N15（扁桃×桃雜交）砧木的研究表明，納米銀（NS）浸泡外植體或添加到培養(yǎng)基中均可減少內(nèi)部、外部污染，也許不久后可以作為升汞的合適替代品[31]。

2 梨組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其添加物

培養(yǎng)基是決定植物組織培養(yǎng)能否成功的最關(guān)鍵因素，通常由基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和其他添加物構(gòu)成。不同品種或同一品種不同的外植體，由于其基因型和外植體類(lèi)型不同，其組培增殖能力、再生率和生長(zhǎng)狀態(tài)等都存在顯著差異，適宜的培養(yǎng)基類(lèi)型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度等也不盡相同[32-33]。

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是培養(yǎng)優(yōu)良組培苗的基礎(chǔ)，篩選適宜不同品種及其外植體的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)研究的一項(xiàng)核心內(nèi)容[34]。培養(yǎng)基類(lèi)型主要有液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，在梨組織培養(yǎng)中一般以固體培養(yǎng)基為主，根據(jù)培養(yǎng)目的，又可細(xì)分為誘導(dǎo)（再生）培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基3 類(lèi)。目前，梨組織培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基主要有MS、1/2MS、NN69、WPM、B5、QL 等[35]。

趙亞楠等[36]采用交叉組合設(shè)計(jì)，從MS、1/2MS、WPM 和NN694 種培養(yǎng)基中，篩選出NN69是最適合杜梨組培苗生根的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。盧明艷等[37]以抗寒耐鹽堿梨砧木優(yōu)系1-127 為試材，證明WPM 是其增殖和生根培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。孫清榮等[13]通過(guò)比較紅星梨無(wú)菌苗在不同繼代培養(yǎng)基上的增殖生長(zhǎng)，得出1/2MS 培養(yǎng)基比MS、QL 更有利于提高無(wú)菌苗的增殖效率。王勝男等[18]通過(guò)摸索最適合京白梨增殖培養(yǎng)與生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基，得出MS 是最適宜的增殖培養(yǎng)基，1/2MS 是最佳生根培養(yǎng)基；苗冉冉等[17]在建立津香蜜和巴梨組培快繁體系時(shí)也得出了類(lèi)似的結(jié)論。Lane 等[38]對(duì)日本砂梨品種的葉片進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)B5 要比MS 更有利于葉片再生；而秦璐等[39]以庫(kù)爾勒香梨葉片為試材誘導(dǎo)不定芽再生，結(jié)果表明NN69相比于MS、B5 具有更高的再生率。

以上研究結(jié)果說(shuō)明，不同品種或同一品種不同的外植體，在不同培養(yǎng)階段適用的培養(yǎng)基類(lèi)型有所差異。但MS 是梨組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基類(lèi)型且多用于繼代增殖培養(yǎng)，而1/2MS 則更適合作為生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基。NN69對(duì)梨葉片不定芽誘導(dǎo)的高效性已經(jīng)被很多人證實(shí)，目前多用于作為梨再生試驗(yàn)的基本培養(yǎng)基。

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)及配比對(duì)梨的離體再生效果起著關(guān)鍵性的作用。有研究認(rèn)為，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)、濃度及配比不同造成組培材料生長(zhǎng)和分化能力的不同，可能是因?yàn)樗鼈兇碳ち瞬煌蚩刂频拿割?lèi)，從而影響內(nèi)源激素的分布水平，進(jìn)而在生長(zhǎng)和分化上形成差異[11]。目前，在梨組織培養(yǎng)中，主要應(yīng)用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括生長(zhǎng)素類(lèi)、細(xì)胞分裂素類(lèi)以及赤霉素類(lèi)等。

生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)是梨組織培養(yǎng)中不定根誘導(dǎo)所必需的，常見(jiàn)的類(lèi)型有：萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）4 種。王金祥等[40]已經(jīng)證明，IAA 是啟動(dòng)不定根形成的重要因子，在根原基誘導(dǎo)階段起著至關(guān)重要的作用。相比于IAA，IBA 更加穩(wěn)定，可以刺激嫩葉和嫩芽形成的IAA 運(yùn)至基部，從而促進(jìn)生根[40]。NAA 雖然不直接參與根的形成，但它可以促進(jìn)組培苗中的淀粉水解為還原糖，有利于不定根的形成[41]。生長(zhǎng)素單一使用與混合使用對(duì)不同梨品種生根的作用是不同的。趙亞楠等[36]通過(guò)篩選杜梨組培苗不定根原基誘導(dǎo)的激素配方，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用1.0 mg/L IBA的生根效果較好，但I(xiàn)BA和IAA各1.0 mg/L混合處理時(shí)卻抑制了組培苗的生根，而使用IAA 和NAA 各1.0 mg/L 的組合時(shí)生根率和生根數(shù)達(dá)到最高，說(shuō)明合適的生長(zhǎng)素組合共同誘導(dǎo)杜梨組培苗生根效果優(yōu)于單一生長(zhǎng)素處理。2,4-D 具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的作用[42]，常應(yīng)用于愈傷組織誘導(dǎo)[43]，但是在梨組織培養(yǎng)中應(yīng)用較少，常用的生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)是NAA、IAA 和IBA 3 種。

細(xì)胞分裂素常見(jiàn)的類(lèi)型有芐氨基腺嘌呤（BA）、噻苯?。═DZ）、玉米素（ZT）和激動(dòng)素（KT）等。相比于TDZ，BA 能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的腋芽，增殖效率更高，而TDZ 比BA 更有利于促進(jìn)無(wú)菌苗葉片的伸展增大，更有利于壯苗生長(zhǎng)[13]。細(xì)胞分裂素通常與生長(zhǎng)素一起使用，二者相輔相成，能夠達(dá)到更好的培養(yǎng)效果。王月等[8]在研究不同濃度TDZ 和IBA對(duì)青砧D3 離體葉片不定芽再生的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)TDZ和IBA 組合使用效果優(yōu)于單獨(dú)使用，當(dāng)3.0 mg/L TDZ 和0.3 mg/L IBA 組合時(shí)不定芽再生率和再生芽數(shù)均達(dá)最高，分別為100%和7.69 個(gè)，而單獨(dú)使用TDZ 時(shí)不定芽誘導(dǎo)率為86.67%。苗冉冉等[17]也證明了BA 和NAA 的組合更適合津香蜜和巴梨的繼代增殖培養(yǎng)。ZT 主要在梨體外器官發(fā)生細(xì)胞分化中起重要作用，但實(shí)際中不常用[44]。然而在對(duì)其他植物的組培研究中，張虎等[45]發(fā)現(xiàn)ZT 對(duì)芫花莖段外植體上腋芽萌發(fā)的促進(jìn)效果顯著優(yōu)于BA；魏麗萍等[46]證明了含KT 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)藥用植物山烏龜?shù)牟欢ㄑ啃Ч麅?yōu)于TDZ。在梨組織培養(yǎng)中常用的細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)是BA 和TDZ。一般來(lái)說(shuō)，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值較低，則有利于促進(jìn)不定芽形成；生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值較高，則有利于促進(jìn)不定根的形成。不同的品種其最適宜的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的種類(lèi)和濃度也各不相同。

赤霉素類(lèi)（GAs）在木本植物組織培養(yǎng)的研究中應(yīng)用較多的是GA3，其作用類(lèi)似于生長(zhǎng)素，但又有所區(qū)別。GA3對(duì)芽的增殖和伸長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但一般不單獨(dú)使用，通常與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合使用能夠取得較好的效果[47]。劉春等[3]發(fā)現(xiàn)，在6-BA 濃度不變的條件下，降低NAA 濃度、提高GA3濃度或提高NAA 濃度、降低GA3濃度均能促進(jìn)梨組培苗的增殖。另外，在進(jìn)行組織培養(yǎng)之前，對(duì)外植體進(jìn)行一定濃度的GA3預(yù)處理是有利于生長(zhǎng)的。陳麗靜等[23]對(duì)南果梨莖尖進(jìn)行0.1 mg/L GA3預(yù)處理1 周，其生長(zhǎng)增殖率能達(dá)到84%，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)GA3沒(méi)有促進(jìn)根的生成反而起抑制作用。

多胺（Polyamiens）是普遍存在于植物體內(nèi)的另一種植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)物質(zhì)，以精胺、亞精胺、腐胺3 種最為常見(jiàn)，一些多胺有利于生根和芽增殖，而另一些多胺則有利于胚胎發(fā)生、愈傷組織誘導(dǎo)和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[48]。閆帥等[49]以杜梨繼代苗為材料，分別在生根誘導(dǎo)0、3、7、10、15 d 后，測(cè)定分析了基部莖段多胺類(lèi)物質(zhì)含量，結(jié)果表明亞精胺在杜梨不定根誘導(dǎo)和發(fā)生過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。崔寶明[50]研究發(fā)現(xiàn)，外施72.6 mg/L 亞精胺可顯著提高玉米芽再生效率，但在梨上還未見(jiàn)多胺類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)再生效果的報(bào)道。此外，油菜素內(nèi)酯（Brassinolide）作為一種新型生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用研究。張婭等[51]在甘蔗組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)酯及其類(lèi)似物對(duì)其不定根誘導(dǎo)和再生培養(yǎng)體系構(gòu)建的促進(jìn)效果明顯，在添加5 mg/L 油菜素內(nèi)酯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的材料有更強(qiáng)的生命力及更高的成活率，而梨上尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素是現(xiàn)階段梨組織培養(yǎng)中應(yīng)用較為廣泛的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，研究?jī)?nèi)容主要是以1 種生長(zhǎng)素搭配1 種細(xì)胞分裂素的組成方式配比，在繼代培養(yǎng)中還需添加一定濃度的赤霉素以達(dá)到促進(jìn)新梢生長(zhǎng)的作用。關(guān)于多胺、油菜素內(nèi)酯等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在梨組織培養(yǎng)中應(yīng)用的報(bào)道不多，研究?jī)?nèi)容較單一，沒(méi)有涉及與其他生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的互作關(guān)系，今后可考慮往這一方面進(jìn)一步深入研究。

2.3 碳源

碳源一般是糖類(lèi)物質(zhì)，是植物組織培養(yǎng)中滲透壓的調(diào)節(jié)物質(zhì)及能量的主要來(lái)源，同時(shí)還可以調(diào)控與植物新陳代謝有關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育[52]。梨組織培養(yǎng)中常用的碳源物質(zhì)有蔗糖、山梨醇、葡萄糖等，不同品種所適宜的碳源不盡相同。孫清榮等[13]通過(guò)研究碳源對(duì)西洋梨品種紅星葉片不定梢再生能力的影響，發(fā)現(xiàn)d-山梨醇相比于蔗糖更有利于提高離體葉片不定梢再生率。因此，在植物組織培養(yǎng)工作中應(yīng)當(dāng)要考慮到適合該品種的碳源種類(lèi)及濃度。

2.4 活性炭

活性炭（AC）具有吸附作用，在植物組織培養(yǎng)中，添加一定量的活性炭可吸附植物分泌的有害物質(zhì)，同時(shí)可提供生根的暗環(huán)境，有利于根的誘導(dǎo)和根系生長(zhǎng)，防止褐變，提高培養(yǎng)體內(nèi)可溶性蛋白和總糖的含量[53]。欒曉龍等[54]通過(guò)分析不同的活性炭含量對(duì)秋子梨組培苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明加入活性炭的組培苗在生根率、生根數(shù)、根長(zhǎng)等方面均顯著高于對(duì)照組，并篩選出了最適宜秋子梨生根的培養(yǎng)基為1/2MS＋I(xiàn)BA（0.5 mg/L）＋AC（1.0 g/L），生根率達(dá)到了90%。

2.5 硝酸銀

在梨再生培養(yǎng)基中添加一定濃度的硝酸銀（AgNO3），可以有效提高葉片不定芽的再生率。鐘穎等[7]通過(guò)建立庫(kù)爾勒香梨葉片再生體系，發(fā)現(xiàn)AgNO3濃度為0.5 mg/L 與TDZ 和IBA 組合，有利于庫(kù)爾勒香梨葉片愈傷組織誘導(dǎo)不定芽。另外，有研究表明，AgNO3通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)乙烯的作用位點(diǎn)抑制乙烯的合成及信號(hào)的傳導(dǎo)，能夠控制和逆轉(zhuǎn)組培苗的玻璃化現(xiàn)象[55]。

2.6 納米硅

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)納米硅材料展開(kāi)了深入研究，并且開(kāi)始應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。研究表明，在某些情況下納米硅通過(guò)參與植物自身組織或細(xì)胞器的構(gòu)建，影響其生理活性物質(zhì)的合成，從而調(diào)節(jié)生理代謝活動(dòng)，同時(shí)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[56]。Avestan 等[57]在瓊脂誘導(dǎo)滲透脅迫條件下，在培養(yǎng)基中添加50～100 mg/L 納米硅可以顯著提升蘋(píng)果外植體的增殖率，研究表明使用納米硅可以改善植物生長(zhǎng)和對(duì)壓力的耐受性。崔云浩等[58]以甜椒幼苗為材料，探究鹽脅迫下外源噴施納米硅對(duì)甜椒生長(zhǎng)和生理特性的影響，結(jié)果表明納米硅通過(guò)調(diào)節(jié)甜椒植株體內(nèi)抗氧化酶活性，降低植株氧化損傷，從而提高甜椒的耐鹽性。目前，納米硅在梨組織培養(yǎng)上應(yīng)用的報(bào)道比較罕見(jiàn)，有待進(jìn)一步研究。

3 梨組織培養(yǎng)的培養(yǎng)條件

3.1 光照

光照條件對(duì)梨葉片不定芽發(fā)生和組培苗不定根誘導(dǎo)具有重要影響。發(fā)光二極管（LED）由于其低能耗、低熱輻射、特定波長(zhǎng)輻照等特點(diǎn)，已逐漸取代熒光燈（FL）成為植物組織培養(yǎng)的常用光源[59]。Lotfi 等[60]以梨組培苗為材料比較藍(lán)光、紅光和遠(yuǎn)紅光LED 光源對(duì)其增殖和生根的影響，結(jié)果表明藍(lán)光促進(jìn)愈傷組織的重量增加，遠(yuǎn)紅光有利于枝梢數(shù)量的增加但枝梢質(zhì)量較差，紅光更有利于生根，生根率達(dá)到100%。另外，Dimitrova 等[59]發(fā)現(xiàn)，白光加藍(lán)光LED 燈組合能夠顯著增加梨組培苗的株高。

通常條件下，外植體經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的暗培養(yǎng)可產(chǎn)生大量生長(zhǎng)狀態(tài)良好、健壯的愈傷組織，這類(lèi)愈傷組織易于繼代培養(yǎng)和不定芽、不定根誘導(dǎo)。王月等[8]研究發(fā)現(xiàn)，青砧D3 離體葉片接種后暗培養(yǎng)7 d愈傷組織開(kāi)始產(chǎn)生，暗培養(yǎng)14 d 移至光下培養(yǎng)（光照時(shí)間16 h/d），4 d 后開(kāi)始有不定芽的產(chǎn)生。趙亞楠等[36]進(jìn)行杜梨組培苗生根培養(yǎng)，采用混合光（紅∶藍(lán)∶白＝3∶1∶1），先暗培養(yǎng)7 d 后移至光照培養(yǎng)（光照時(shí)間14 h/d，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx），生根率達(dá)到了96%。

3.2 溫度

在植物組織培養(yǎng)中，一般采取最適溫度并保持恒溫培養(yǎng)。梨組織培養(yǎng)中一般采用23～26 ℃的溫度進(jìn)行培養(yǎng)，低于15 ℃培養(yǎng)的組織生長(zhǎng)停滯，而高于35 ℃對(duì)生長(zhǎng)不利[61]。房洪舟等[62]探討了不同溫度對(duì)刺梨愈傷組織增殖倍數(shù)的影響，結(jié)果表明愈傷組織增殖倍數(shù)在3 個(gè)培養(yǎng)溫度（20、25、30 ℃）中表現(xiàn)出了較大的差異，其中25 ℃下培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度最快、增殖倍數(shù)最高。

3.3 pH 值

pH 值是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中能否正常吸取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要影響因素。另外，pH 值能夠影響培養(yǎng)基的凝固程度，當(dāng)pH 值較低時(shí)培養(yǎng)基難以凝固，而較高時(shí)培養(yǎng)基比較堅(jiān)硬不利于接種。梨組織培養(yǎng)中，pH 值一般設(shè)置為5.8 就能夠取得良好的效果。

4 梨組織培養(yǎng)中存在的問(wèn)題

4.1 污染

在梨組織培養(yǎng)中，污染表現(xiàn)可以分為真菌污染和細(xì)菌污染。真菌污染通常來(lái)源于空氣，孢子在適宜的環(huán)境中會(huì)迅速地增長(zhǎng)，對(duì)組培設(shè)備、容器等造成污染，其明顯的特征在于產(chǎn)生面積較廣的菌落，同時(shí)還會(huì)形成多種顏色的絨毛狀菌斑，且?guī)в忻刮?；而?xì)菌污染一般是由外植體內(nèi)部與體表攜帶細(xì)菌引起的污染情況，病原菌大部分存儲(chǔ)在植物內(nèi)部，通過(guò)一定的載體進(jìn)行傳播，其特征主要以黏液狀物體、渾濁水跡狀以及泡沫發(fā)酵狀等多種形態(tài)表現(xiàn)，影響較為嚴(yán)重[63]。

常采用的組培污染防治方法是在培養(yǎng)基中添加各種殺菌劑。盧明艷等[64]以秋子梨污染組培苗為材料，研究山農(nóng)一號(hào)殺菌劑對(duì)污染組培苗抑菌效果和生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，山農(nóng)一號(hào)I 型和III 型殺菌劑配合使用對(duì)污染組培苗有顯著的抑菌效果，并且組培苗的恢復(fù)率在70%以上，增殖倍數(shù)在1～3倍。白一葦?shù)萚65]利用含有25 mg/L 頭孢霉素＋30 mg/L 代森錳鋅與百菌清1∶1 混合液的培養(yǎng)基，并在外植體插入培養(yǎng)基前利用100 mg/L 多菌靈藥液或100 mg/L 代森錳鋅與百菌清1∶1 混合液進(jìn)行浸潤(rùn)包衣，可顯著降低組培材料被污染的風(fēng)險(xiǎn)，且對(duì)除愈傷組織以外的外植體的生長(zhǎng)發(fā)育影響較弱。

除此之外，在進(jìn)行組培前要科學(xué)合理地選擇外植體，選好外植體之后，對(duì)其進(jìn)行細(xì)致清潔和消毒，接種前對(duì)設(shè)備消毒、人員衛(wèi)生控制以及紫外燈照射消毒等措施也能夠減輕污染程度。

4.2 褐化

梨外植體在組培過(guò)程中極易發(fā)生褐化，給梨無(wú)菌系的建立帶來(lái)了極大困難。褐化發(fā)生機(jī)制分為由多酚氧化酶作用于酚類(lèi)物質(zhì)引起的酶促褐化，以及由組培傷口、培養(yǎng)條件導(dǎo)致的脅迫褐化2 種類(lèi)型[66]。

一般外植體中酚類(lèi)物質(zhì)含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季較弱，以后逐漸增強(qiáng)使褐變加重。有研究表明，適度的低溫對(duì)梨莖尖的酶促褐變有顯著的抑制作用，但是低溫處理會(huì)對(duì)外植體后期生長(zhǎng)帶來(lái)不利影響，處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)[67]。通過(guò)在培養(yǎng)基中加入活性炭、抗氧化劑等，褐變程度均顯著降低[4]。另外，劉杰等[67]發(fā)現(xiàn)，梨組培苗的多酚物質(zhì)含量大大低于田間外植體材料。因此，在建立梨離體再生體系時(shí)，可以考慮以室內(nèi)枝條水培催出的嫩芽為外植體進(jìn)行接種。

5 梨組織培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用

由于梨的童期長(zhǎng)、基因高度雜合、遺傳背景復(fù)雜，使得常規(guī)的育種周期長(zhǎng)、成效低、工作量大。隨著近些年分子生物學(xué)的發(fā)展，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)能夠通過(guò)定向引入外源基因，提高改良效果，加快育種進(jìn)程，而高效的組織培養(yǎng)再生體系的建立則是基因轉(zhuǎn)移的前提條件[68]。20 世紀(jì)90 年代隨著梨葉片再生體系相繼被報(bào)道[6]，Mourgues 等[69]首次通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將GUS及nptII基因?qū)胛餮罄婵蹈愃?，并獲得高達(dá)42.7%的遺傳轉(zhuǎn)化率。此后，梨的遺傳轉(zhuǎn)化普遍采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，即利用攜帶外源基因的農(nóng)桿菌菌液侵染梨的外植體器官，然后對(duì)其進(jìn)行再生培養(yǎng)，通過(guò)篩選后得到轉(zhuǎn)基因植株。目前，梨中導(dǎo)入的外源基因主要為抗病、乙烯調(diào)控及矮化基因，并且在西洋梨[69-70]、白梨[71]、砂梨[72]、秋子梨[73]、杜梨[74]中均取得梨轉(zhuǎn)基因植株。

6 展望

雖然前人在梨組織培養(yǎng)研究中取得了突破性進(jìn)展，為梨無(wú)性系苗木繁育和遺傳轉(zhuǎn)化等研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，但在組培過(guò)程中還存在外植體褐化嚴(yán)重、增殖系數(shù)低、生根誘導(dǎo)困難和再生率低等問(wèn)題。因此，在今后的梨組織培養(yǎng)研究中，應(yīng)從基因型選擇、基本培養(yǎng)基改良、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比和培養(yǎng)方法創(chuàng)新等方面開(kāi)展深入研究，以期有效解決上述問(wèn)題，并將其更好地應(yīng)用于梨無(wú)性系苗木的繁育和生物育種研究中。