活細胞內鄰近標記技術的研究進展

葛陽陽，丁 明

（中國藥科大學，江蘇 南京 210009）

蛋白質通常形成復合物并產生對細胞結構和功能完整性至關重要的相互作用網絡，無論是細胞生長、運動、細胞信號傳導還是新陳代謝，蛋白質相互作用網絡在細胞機制的各個層面都發揮著至關重要的作用。生物功能的執行和人類疾病的進展都與蛋白質相互作用（Protein-Protein Interactions，PPI）密切相關。而蛋白質相互作用的失調與多種人類疾病有關，包括癌癥、免疫疾病和神經退行性疾病。全面了解蛋白質相互作用可為治療腫瘤提供理論依據。蛋白質相互作用是一種動態的調控，會受到多種因素的影響，如細胞周期的改變、翻譯后修飾、蛋白質構象的改變等，具有瞬時及弱相互作用的特點。這些特點對研究蛋白質相互作用造成了重大挑戰。

傳統研究蛋白質相互作用的方法是親和純化和酵母雙雜交[1-2]，但是這2種方式適合研究穩定的蛋白質相互作用，比如親和純化會在細胞裂解和隨后的洗滌步驟中導致弱或短暫的相互作用通常會丟失，然而酵母雙雜交不適合研究膜蛋白，并且存在著高假陽性結果。接近標記技術（Proximity Labeling，PL）是為彌補這些傳統方法在研究蛋白質相互作用的缺陷上開發出來。鄰近標記技術是使用工程酶，例如工程抗壞血酸過氧化物酶或生物素連接酶，在感興趣的蛋白（誘餌蛋白）上融合這些工程酶，酶將惰性小分子底物轉化為短壽命的活性物質，從酶活性位點擴散出來以共價標記相鄰的內源蛋白，從而研究蛋白質相互作用。本文將介紹目前鄰近標記技術在蛋白質相互作用中的研究進展。

1 鄰近標記技術分類

1.1 BioID

BioID是在2012年發現并推出，該方法利用BirA生物素連接酶的天然能力對蛋白質進行生物素化[3]。大腸桿菌中提取到這個酶，發現該酶在ATP和生物素存在的情況下，會產生活性物質biotin-AMP，然后活性物質會轉移到鄰近靶蛋白的表面的伯胺賴氨酸上。為了更廣泛地標記附近的蛋白質，第一代BioID使用BirA*（R118G）。與BirA相比，BirA*對biotin-AMP的親和力較低，這可以在10 nm半徑內釋放更多的活性物質，更好地對周圍蛋白質進行生物素化[4]。BioID需要相對較長的標記時間，以清楚地標記相互作用的蛋白。在2016年，KIM等[5]提出了基于Aquifex aeolicus發現的BioID2（R40G），它缺少了DNA結合區域，因此分子量要比BioID小8 kDa，從而可能最大限度地減少對誘餌蛋白的功能干擾。BioID2與BioID相比顯示出更高的活性并且需要更少的生物素。同樣，BASU是一種來自Bacillussubtilis的BirA，與BioID和BioID2相比，具有更高的生物素化活性[6]。與BioID2一樣，BASU缺少N端DNA結合結構域，并且分子量比BioID小。

1.2 BioID突變體

研究者為進一步提高BioID酶的活性，通過使用基于酵母展示的定向進化，設計了2種增強的BioID變體：35 kDa TurboID和28 kDa miniTurbo[7]。最后，這些變體顯示出顯著的標記能力，將標記時間從16～18 h縮短到10 min，其大小和特異性與BioID相似。此外，與BioID和BioID2蛋白相比，TurboID和miniTurbo的鄰近標記活性在不同的pH范圍和低溫下是穩定的[7]。有趣的是，研究者將BioA*酶分為2個片段而開發出Split-BioID方法。Split-BioID可以用于研究二聚化依賴性蛋白質相互作用，將BirA*分為2個片段，分別連接到2個相互作用的蛋白上，在2個相互作用的蛋白靠近形成蛋白質復合體時，BirA*重新組裝恢復活性從而生物素化底物和其他鄰近蛋白質[8]。

1.3 APEX

2013年開發出APEX方法，該方法基于與BioID相同的原理[9]。它使用一種與BioA*不同的酶——單體抗壞血酸過氧化物酶，對誘餌蛋白質附近的蛋白質進行生物素化。原理是在過氧化氫存在下，該酶將生物素-苯酚氧化為生物素苯氧基，這是一種半衰期短的自由基，會與富含電子的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、組氨酸和半胱氨酸）發生共價反應，在誘餌蛋白質周圍約20 nm的半徑內標記蛋白，標記反應可以通過去除H2O2和添加淬滅緩沖液來停止，隨后可以使用鏈霉親和素珠分離得到的生物素化蛋白質，并通過MS進一步分析。APEX技術與第一代BioID技術的主要區別在于生物素化蛋白質所需的孵育時間。由于過氧化氫對細胞的毒性，隨后開發了第二代APEX（A134P）以提高酶的催化效率，減少因暴露于過氧化氫而引起的細胞應激反應，并允許對感興趣的蛋白質的較低表達水平進行研究[10]。與BioID技術相比，APEX酶活性更高，所標記的蛋白數量更多，但是暴露于過氧化氫還可以通過激活信號通路以響應氧化應激、細胞器動力學或整個蛋白質相互作用來改變細胞的生理機能，出現假陽性的結果。與BioID相同，APEX技術也擴展到利用互補進行鄰近標記的Split-APEX技術，原理與Split-BioID相同。

1.4 PUP-IT技術

除了上述3中鄰近標記技術以外，研究者還開發了一種使用細菌Paf A酶的新鄰近標記技術——PUP-IT[11]。與使用BioID和APEX不同，PUP-IT使用稱為Pup的小蛋白質標記蛋白質。將PafA與誘餌蛋白融合，隨后會將Pup連接到附近的任何賴氨酸殘基上，從而發現目標蛋白，使其成為一種潛在有用的鄰近標記酶。

2 鄰近標記的應用

2.1 蛋白質相互作用網絡

近年來，鄰近標記技術已經越來越多地被應用于蛋白質相互作用網絡的研究。BioID最初是為研究哺乳動物細胞中的體內核lamin-A而開發的[3]。現如今BioID已成功應用于多種細胞內環境。在哺乳動物細胞中，BioID被應用于探測不同亞細胞結構的蛋白質相互作用網絡，例如核孔復合物、線粒體和中心體-纖毛界面等。CHOU等[12]使用BioID來識別TDP43聚集體的相互作用物，TDP43聚集體是神經退行性疾病的常見組織病理學標志物，包括肌萎縮側索硬化和額顳葉癡呆。通過將BioID與TDP43融合以進行鄰近標記技術，研究者確定了核質轉運機制。后續研究還表明，TDP43聚集體破壞核孔蛋白和轉運因子功能。蛋白質相互作用在細胞信號轉導通路中發揮著重要作用，但其中上游和下游蛋白或小分子僅與感興趣的蛋白質之間是短暫相互作用，對研究信號通路造成了重大挑戰。COUZENS等[13]使用BioID探測Hippo通路中的相互作用物，Hippo信號通路控制細胞增殖和凋亡以決定器官大小。通過使用BioID繪制19種途徑蛋白的相互作用組，研究者為Hippo途徑生成了蛋白質相互作用網絡，并確定了許多推定的調節劑和激酶底物。后續不同的研究者通過鄰近標記技術繪制了不同信號通路的蛋白質相互作用網絡，比如 NF-κB[14]、Ras[15]、MAPK[16]等。APEX技術1 min的標記時間框架可以被利用來捕捉動態細胞過程中所涉及的蛋白質相互作用組變化。PAEK等[17]用APEX技術探究激活劑激活后血管緊張素II 1型受體（AT1R）和β2-腎上腺素能受體（β2AR）的信號傳導過程，APEX還被用于探究激動劑治療后δ-阿片受體相互作用組的變化。

2.2 蛋白質與DNA相互作用

蛋白質與DNA相互作用對于基因表達、基因組完整性和染色質組織的調節至關重要。ChIP-seq被廣泛用于捕獲和測序與誘餌蛋白質相關的DNA區域。這種鄰近標記技術適合運用在活細胞中，并使用過氧化物酶APEX對靠近誘餌的蛋白質進行生物素化，這些蛋白質又通過甲醛交聯到相鄰的DNA區域。隨后，生物素化的蛋白質-DNA片段復合物通過鏈霉親和素進行富集，并通過下一代測序進行分析。最近，ChromID被用于研究特定染色質標記處的蛋白質相互作用組，該方法鑒定了在組蛋白H3 Lys4和Lys27[18]上三甲基化修飾的啟動子區域。盡管酶的存在可能會影響與染色質結合的相互作用蛋白，但這些研究提供了一種工具來研究染色質功能的調節機制。基于APEX的鄰近標記技術也被用于繪制與線粒體DNA相關的蛋白質圖譜，揭示了7種以前未知的線粒體類核相關蛋白[13]。

2.3 蛋白質與RNA相互作用

蛋白質和RNA之間的相互作用對于廣泛的細胞功能也是至關重要，目前鄰近標記技術已與蛋白質-RNA交聯相結合，以在特定亞細胞區域發現接近誘餌蛋白質的RNA。APEX-RIP[19]使用甲醛，在細胞裂解前將APEX生物素化蛋白質與RNA交聯，從而實現基于鏈霉親和素的蛋白質-RNA復合物富集。APEX-RIP和Proximity-CLIP已應用于研究內質網膜、核纖層和細胞表面[20]的RNA。FAZAL等[21]使用APEX-seq生成轉錄組范圍的人類成纖維細胞亞細胞RNA圖譜，發現了轉錄本位置與基因組結構和蛋白質定位之間的關聯。

3 總結

自從鄰近標記技術問世以來，越來越多的研究者將其應用于各個領域，比如植物、斑馬魚、蠕蟲等。本文介紹了目前使用的鄰近標記技術及其應用，鄰近標記技術的出現為蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA相互作用的研究提供了很大幫助，鄰近標記技術有著傳統方法不能相比的優勢，它可以捕捉弱、瞬時的的蛋白質相互作用，可以在空間和時間上監測細胞的動態變化過程。同時各種鄰近標記酶的發現與優化加速了細胞圖譜的繪制進行，加速了對細胞信號通路的研究。隨著鄰近標記技術的蓬勃發展，將為廣大的研究者提供新的思路，推動一些重要生命科學問題的解決，為發現一些疾病的發病機制提供新方法。