血清尿酸參考測量程序的優化及其在常規系統中的應用

孫江漫， 孟祥兆， 李 敏， 邵 燕， 于洪遠

（北京航天總醫院檢驗科，北京 100076）

尿酸作為抗氧化劑，占人體生物體液總抗氧化能力的50%。當存在于細胞質或動脈粥樣硬化斑塊的酸性/疏水環境中時，尿酸會轉化為促氧化劑，促進氧化應激，并通過這種機制參與人類疾病的病理生理過程。尿酸對腎臟的影響包括腎結石和腫瘤溶解情況下的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。有研究發現，血清尿酸水平升高與心血管疾病之間也存在關聯，包括冠心病（coronary heart disease，CHD）、中風、充血性心力衰竭、動脈高血壓、心房顫動，以及因心血管疾病導致的死亡風險增加；尿酸升高與心血管疾病、代謝綜合征、胰島素抵抗、肥胖、非酒精性脂肪肝和慢性腎病也存在關聯[1]。尿酸的測定方法有磷鎢酸法、尿酸酶法、高效液相色譜-質譜法。目前，臨床實驗室測定尿酸主要采用酶法，特異性高、操作較簡單。酶法又分為紫外分光光度法和酶偶聯法。本研究擬對美國臨床化學協會（American Association for Clinical Chemistry，AACC）推薦的血清尿酸參考測量程序（簡稱參考方法）進行優化，以期為尿酸常規測量系統的建立和溯源提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集4 0份無溶血、黃疸、乳糜的臨床剩余單人份血清（尿酸濃度為166.81～1 089.61 μmol/L），用于方法學比較。標準曲線配制采用美國國家標準和技術研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）標準品SRM 913b（99.8%±0.2%），正確度驗證采用標準品SRM 909C[（278.57±5.95）μmol/L]和國際比對樣本RELA20B、RELA21A。

1.2 主要儀器和試劑

carry100紫外可見分光光度儀（美國安捷倫公司）、ARCHITECT c16000全自動生化分析儀（美國雅培公司）及配套尿酸檢測試劑（16043UN20）、校準品（50078FD01）和多項定標液（50078FD01）；美國sigma公司Trisbase（T1503）、Tris-HCl（T3253）、三氯乙酸（T9159）、碳酸鋰（62470），北京阿匹斯公司牛血清白蛋白（AC0012B）、瑞士Roche公司尿酸酶（10828475）。

1.3 方法

1.3.1 尿酸參考方法的建立 按照AACC推薦的尿酸酶法，并參考文獻[2-3]建立血清尿酸測定參考方法，其原理是尿酸酶可特異性地水解尿酸，生成尿囊素，尿酸在293 nm處有特征性的吸收峰，根據反應前后吸光度的變化測量樣本中的尿酸含量。操作流程：（1）將0.5 mL樣本、2.5 mL Tris-buffer置于15 mL離心管，在測試管中加入1 mL 0.1 U/L尿酸酶，（37±1）℃水浴60 min；（2）在測試管中加入2 mL 10%三氯乙酸，空白管中加入3 mL 10%三氯乙酸-尿酸酶，放置45 min；（3）將測試管和空白管以1 200×g離心40 min，取上清液，測定293 nm處吸光度值。

1.3.2 尿酸參考方法的優化 對建立的尿酸參考方法進行優化，將最終的反應液以1 200 ×g離心40 min，收集上清，移至新的離心管，再次離心15 min，以更徹底地去除干擾。

1.3.3 正確度驗證 采用SRM909C和國際比對樣本RELA20B、RELA21A進行正確度驗證。

1.3.4 精密度驗證 留取高值（701.45 μmol/L）、中值（424.22 μmol/L）、低值（221.34 μmol/L）臨床剩余血清樣本，每個濃度值每天測定5次，連續5 d。

1.3.5 線性評估 參考方法的線性范圍為119.05～1 190.48 μmol/L，留取接近線性范圍的高值（1 091.67 μmol/L）、低值（144.05 μmol/L）臨床混合血清樣本，按照1L、0.8L∶0.2H、0.6L∶0.4H、0.4L∶0.6H、0.2L∶0.8H、1H的方式配置6個濃度梯度，計算各濃度梯度的理論濃度。

1.3.6 方法學比對 采用優化后的參考方法和臨床常規測量系統[c16000全自動生化分析儀及配套尿酸檢測試劑（16043UN20）、校準品]同時測量40份單人份臨床剩余血清樣本。比較2種方法檢測結果。（1）參考美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP9-A3文件[4]，將參考方法作為參比方法，計算常規方法與參考方法的偏差，以參考方法測定結果為X軸，以2種方法的偏差為Y軸，繪制偏差圖，觀察2種方法偏差趨勢。（2）根據CLSI EP9-A3文件，采用廣義極端學生化偏差（extreme studentized deviate，ESD）法進行離群值檢驗。（3）根據偏差圖建立回歸分析模型，計算斜率、截距、相關系數、95%可信區間（confidence interval，CI），預估醫學決定水平處的偏移，觀察其是否在臨床可接受范圍內。

1.3.7 互換性評價 根據CLSI EP14-A3文件要求[5]，采用參考方法和臨床常規測量系統同時測量40份單人份臨床剩余血清樣本，常規方法使用的校準品穿插其中，繪制偏差圖，若2種方法測定結果的偏差恒定，則進行Deming回歸；若偏差隨濃度增加，則對數據進行對數轉換。以參考方法為參比系統，95%預測區間為判斷標準[6]，對常規方法使用的校準品進行互換性分析。

1.4 統計學方法

采用MedCalc軟件進行離群值檢測和passing-bablok回歸分析，采用Excel 2019軟件進行Deming回歸分析和配對t檢驗。

2 結果

2.1 正確度驗證結果

尿酸參考方法優化前后測定SRM 909C、RELA20B、RELA21A的結果均在國際臨床化學和檢驗醫學聯合會（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）等效限范圍內（±3.25%），且SRM909C優化前后的測量結果均在證書范圍內[（278.57±5.95）μmol/L]。見表1。

表1 正確度評價結果

2.2 精密度驗證結果

優化后的尿酸參考方法的重復性和實驗室內精密度均有所提高，優化前的重復性[變異系數（coefficient of variation，CV）為0.19%～1.46%，優化前低值樣本實驗室內復現性精密度＞2%。優化后的重復性（CV）明顯提高（0.05%～0.31%）。實驗室內精密度雖然改善不明顯，但其低值精密度有很大改善，達到了實驗室對精密度的要求（CV＜2%）。見表2、表3。

表2 優化前后重復性（CV）結果 %

表3 實驗室內精密度驗證結果

2.3 線性評估結果

優化前后的測量結果無明顯差異（P=0.76）。優化前的線性相關方程為Y=1.01X-0.08（R2=0.999 6），優化后的線性相關方程為Y=1.00X+0.01（R2=0.999 9），優化后的線性相關性更好，斜率更接近1，截距更接近0。

2.4 方法學比對結果

2.4.1 常規方法與參考方法的偏差 常規方法與參考方法之間差異的變化與濃度成比例，即2種方法間的差異為恒定CV，需對常規方法和參考方法進行passing-bablok回歸分析。2種方法偏差圖見圖1。

圖1 常規方法與參考方法的偏差圖

2.4.2 離群值檢測結果 采用MedCalc軟件對2種方法的檢測結果進行離群值檢驗，結果顯示無離群值，且服從正態分布。見圖2。

圖2 常規方法和參考方法百分比差值正態分布圖

2.4.3 回歸分析結果 常規方法和參考方法passing-bablok回歸分析結果顯示，常規方法在醫學決定水平110、480、640 μmol/L處的預期偏移分別是-15.86%、-2.03%、-1.01%，其中110 μmol/L處的偏移超過臨床可接受范圍（4.50%）[7]，且隨樣本濃度的增大而減小。見圖3。

圖3 常規方法與參考方法的Passing- bablok回歸分析

2.5 互換性評價結果

根據CLSI EP14-A3文件要求，通過40份單人份臨床剩余血清樣本對常規測量系統中使用的校準品進行互換性分析，結果顯示，2種方法測定結果的偏差為恒定CV，即差異隨濃度而變化，需對結果進行對數轉換，再進行互換性分析。校準品1和2均超出95%可信區間，其在參考方法和常規方法中沒有互換性。見圖4。

圖4 常規方法校準品互換性分析

3 討論

隨著全自動化生化分析儀和相關檢測試劑的多樣化發展，臨床實驗室相關項目的檢測效率和精密度都有所提高。但是由于系統的多樣性、系統組合的隨意性，以及部分臨床實驗室沒有注意校準的溯源性，導致檢測結果的差異越來越大。檢測結果的標準化是實現不同實驗室相同項目檢測結果準確、可比的最有效的措施，量值溯源是實現標準化的重要方法之一。國際組織一般通過建立參考方法、研制參考物質和一致性方案來解決量值溯源的問題[8]。本研究通過優化血清尿酸參考方法，并與常規測量系統進行方法學比對，為尿酸常規測量系統的建立和溯源提供參考。

本研究分析了國際一級標準物質SRM909C和國際比對樣本RELA20B、RELA21A的尿酸測定結果，發現優化后的尿酸參考方法不會導致測量結果不正確，且優化后的重復性有明顯提高，實驗室內精密度也有所改善，其中低值樣本的精密度達到了實驗室的要求（CV＜2%）；優化后的線性相關性更好；提示優化后的尿酸參考方法對正確度無影響，且有更好的精密度和線性相關性。

CLSI推出的新版EP9-A3文件是臨床實驗室進行方法學比對和偏移評估的重要指南。本研究參考CLSI EP9-A3文件對優化后的參考方法與常規測量系統進行方法學比對，結果顯示，在110 μmol/L處的預期偏移為-15.86%，明顯超過尿酸的臨床可接受范圍（4.5%），原因可能是參考方法的線性范圍為119～1 190 μmol/L，無法與常規方法線性范圍（55.92～1 970.24 μmol/L）重疊，即沒有覆蓋醫學決定水平低值（110 μmol/L），無法對常規測量系統低值樣本進行比較。另外，本研究參考EP14-A3文件對常規方法使用的校準品進行了互換性分析，發現2個濃度水平的校準品在2種方法之間沒有互換性，這可能也是醫學決定水平低值樣本的預期偏移較大的原因；還有可能是2種方法的檢測原理略有不同，參考方法的原理是尿酸酶可特異性地將尿酸水解，生成尿囊素，尿酸在293 nm處有特征吸收峰，而尿囊素沒有，根據反應前后吸光度的變化可定量樣本中尿酸的含量；而常規方法的原理是尿酸經尿酸酶氧化生成尿囊素，同時生成過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下與4-氨基安替比林和N-（3-磺丙基）-3-甲氧基-5-甲基苯胺反應生成一種醌亞胺染料，604 nm處吸光度的改變與樣本中尿酸的濃度成正比。

綜上所述，優化后的血清尿酸參考方法精密度和線性更好，可以為臨床常規方法的建立和溯源提供一定的參考。臨床實驗室在建立尿酸常規方法時需重視測量方法的原理和校準品的溯源。