lncRNA 前列腺癌相關轉錄物6及miR-16在人腦膠質瘤組織中的表達及其與預后的關系

王鋼 雷超 溫大平

膠質瘤在原發性中樞神經系統惡性腫瘤中占40%左右[1]。有證據表明，lncRNA在許多生物學過程中起著至關重要的作用，并導致腫瘤的發生發展，其異常表達已在多種人類癌癥中得到證實。前列腺癌相關轉錄物6(PCAT6)是一種與癌癥相關的lncRNA，在結直腸癌、肺癌和膀胱癌等多種腫瘤中存在失調[2-4]。PCAT6可通過多種機制發揮致癌功能，如作為競爭性內源性RNA(ceRNA)與海綿狀miRNA結合并與蛋白質結合以保持其穩定。miR-16位于人類13號染色體上，已被發現在乳腺癌、前列腺癌、慢性粒細胞白血病病人中表達下調。Yang等[5]研究發現，miR-16可通過抑制BCL2和NF-kB1/MMP9信號通路抑制膠質瘤細胞生長和侵襲。本課題組在前期預實驗發現lncRNA PCAT6與miR-16之間存在結合位點，本研究旨在探討lncRNA PCAT6和miR-16在人腦膠質瘤中的表達及意義。

對象與方法

一、對象

2016年6月～2018年6月我院病理科凍存的94例膠質瘤組織作為研究組，其中男性60例，女性34例；年齡28～74歲，平均年齡(56.49±11.37)歲；根據WHO分級，將其分為低級別膠質瘤35例(I級15例，Ⅱ級20例)，高級別膠質瘤59例(Ⅲ級41例，Ⅳ級18例)。均為首次手術，且在術前均未經過放化療。同期顱腦損傷減壓術中切除的腦組織100例作為對照組，其中男性58例，女性42例；年齡26～75歲，平均年齡(57.38±10.92)歲。兩組受試者性別、年齡等比較差異無統計學意義。

二、方法

1.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：通過Trizol法提取各組受試者組織標本的總RNA，并測定RNA的濃度和純度。通過PrimeScriptTM RT Master Mix反轉錄試劑盒(Takara，日本)進行反轉錄，反應體系為：cDNA產物2 μl，2×SYBR? Premix Ex Taq TM II 8 μl，上下游引物各1 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl，RNase-Free H2O 7.6 μl。反應條件為： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、62 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，共40個循環。lncRNA-PCAT6正向引物：5＇-CCCCTC CTTACTCTT GGACAAC-3＇,lncRNA-PCAT6反向引物:5＇-GACCGAATGAGGATGGAGACAC-3＇，miR-16正向引物：5＇-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3＇，miR-16反向引物：5＇-GGCAAGATGCTGGCATAGCTG-3＇，U6正向引物：5＇-CTTCAGCCGGCACAGCT-3＇，U6反向引物：5＇-CGCTAATTTGCGTTCAAACG-3＇。 lncRNA-PCAT6和miR-16的表達水平以2-△△CT表示。

2.隨訪：本研究通過電話或門診對研究組病人進行為期3年的術后隨訪，記錄病人的總生存率，隨訪截止時間為2021年6月，隨訪終點為病人死亡。術后第1年，每3個月1次隨訪，之后每6個月1次隨訪。

三、統計學方法

結果

1.膠質瘤組織中lncRNA-PCAT6和miR-16的相對表達量：研究組腫瘤組織中lncRNA-PCAT6的表達量為3.82±0.36，對照組為1.06±0.09，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，圖1A)，研究組miR-16的表達量為0.45±0.03，對照組為1.12±0.09，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，圖1B)；lncRNA-PCAT6在低級別和高級別腫瘤組織中的表達量分別為2.45±0.31、5.08±0.46，差異有統計學意義(P<0.05)見圖1C。miR-16在低級別和高級別腫瘤組織中的表達量分別為0.68±0.08、0.31±0.04，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1D。

A：膠質瘤組織中lncRNA-PCAT6的表達；B：膠質瘤組織中miR-16的表達；C:lncRNA-PCAT6在不同級別膠質瘤組織中的表達；D：miR-16在不同級別膠質瘤組織中的表達；aP<0.05

2.膠質瘤組織中lncRNA-PCAT6、miR-16表達水平與臨床病理特征的關系：本研究根據lncRNA-PCAT6(3.82±0.36)、miR-16(0.45±0.03)表達水平的平均均數，將膠質瘤病人分為高表達組和低表達組。結果發現，不同lncRNA-PCAT6、miR-16表達水平病人性別、年齡、腫瘤直徑及位置等比較差異無統計學意義(P>0.05)；lncRNA-PCAT6高表達組高WHO分級的病人比例顯著高于lncRNA-PCAT6低表達組，而miR-16高表達組高WHO分級的病人比例顯著低于miR-16低表達組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA-PCAT6、miR-16表達與病人臨床病理特征的關系(例，%)

3.lncRNA-PCAT6、miR-16表達水平與膠質瘤病人的生存分析：lncRNA-PCAT6高表達組生存20例，3年總生存率為39.22%；lncRNA-PCAT6低表達組生存30例，3年總生存率為69.77%(圖2A)。miR-16高表達組生存25例，3年總生存率為60.98%；miR-16低表達組生存16例，3年總生存率為30.19%(圖2B)。

注：A：lncRNA-PCAT6；B：miR-16圖2 lncRNA-PCAT6、miR-16表達水平與膠質瘤病人的生存分析

4.影響病人預后的Cox回歸分析：對表1中具有統計學意義的指標進行Cox多因素回歸分析后發現，高WHO分級、lncRNA-PCAT6高表達及miR-16低表達是影響病人預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響病人預后的Cox回歸分析

討論

膠質瘤病人預后較差。電離輻射、手術和化療治療膠質瘤取得了一些進展，但膠質瘤病人的5年生存率仍然較低。有研究表明，lncRNAs的異常表達與膠質瘤的發生有關。據報道，lncRNA HOTAIR作為ceRNA通過吸附miR-126-5p促進膠質瘤進展[6]。此外，lncRNA MALAT1可以通過miR-129/SOX2軸增強膠質瘤干細胞的活力并促進膠質瘤的發生[7]。PCAT6是一種從人類染色體1q32轉錄而來的lncRNA，在許多癌癥中作為癌基因發揮作用。Wu等[2]研究表明，lncRNA-PCAT6調節結直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶治療的耐藥性。Lv等[8]研究表明，lncRNA-PCAT6在人類宮頸癌中的表達顯著上調，促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制凋亡。Shi等[9]研究證實，lncRNA-PCAT6在非小細胞肺癌中表達上調。本研究結果發現，lncRNA-PCAT6在膠質瘤組織中的表達顯著上調，且WHO分級越高，lncRNA-PCAT6表達水平越高；lncRNA-PCAT6高表達組中高WHO分級的病人比例顯著高于lncRNA-PCAT6低表達組。本研究還發現，lncRNA-PCAT6高表達病人術后3年的生存率低于低表達病人。上述結果說明，lncRNA-PCAT6的表達水平可能與膠質瘤的惡化相關，其可能是膠質瘤的潛在預后預測因子。

有研究證明，LncRNAs可以通過靶向miRNAs來調節腫瘤的發生[10-11]。Xu等[12]研究發現，lncRNA-PCAT6可通過與miR-30的內源性競爭來加速胃癌的發生。Yan等[13]研究證明，lncRNA-PCAT6通過競爭性結合miR-330-5p促進非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。我們在前期通過使用在線數據庫TargetScan(http:www.TargetScan.org/)進行預測，發現lncRNA-PCAT6和miR-16之間存在可能的調控靶點(尚未發表)。miR-16已被發現在人腦膠質瘤細胞中表達下調，且其可通過靶向Zyxin調控細胞的增殖、遷移和侵襲[14]。在本研究中，我們同樣發現miR-16在膠質瘤組織中的表達下調，且WHO分級越高的病人，miR-16表達水平越低；miR-16高表達組中高WHO分級的病人比例顯著低于miR-16低表達組；miR-16高表達病人術后3年的生存率高于低表達組。上述結果同樣說明，miR-16可能是膠質瘤的潛在預后預測因子。

我們通過多因素Cox回歸分析發現，lncRNA PCAT6和miR-16是影響膠質瘤病人預后的獨立危險因素，這一結果提示我們在臨床中需要加強對lncRNA PCAT6高表達和miR-16低表達病人的術后監測，以提前預防疾病復發。但本研究樣本量較小，結果具有一定的局限性，后續還應開展大樣本量的研究。