血清miR-125b-2-3p對閉合性顱腦損傷預后判斷的價值分析

李建 朱林 查正江 劉杰 黃純 李志宏

美國《發病率和死亡率周報》(Morbidity and Mortality Weekly Report,MMWR)數據顯示,相比2007年,2013年顱腦損傷相關的急診就診量增幅超過50%,增加的主要原因是跌倒或高處墜落、物體撞擊和交通事故[1]。顱腦損傷的后果包括認知障礙、行為障礙、心理障礙。徐正芹等[2]研究表明，在急性顱腦損傷中血清外泌體內泛素碳末端水解酶L1及神經絲蛋白輕鏈多肽可作為顱腦損傷的預后標志物。miRNA是一類長度在23 bp左右的單鏈RNA分子，它們不表達蛋白質，但參與轉錄后基因表達調控。有研究發現 ，microRNA(miRNA) 可以作為疾病生物標志物。全血或特定血液成分中的miRNA是疾病診斷和預后的潛在標志物[3-4]。有研究表明，miR-125b-2-3p與腫瘤的惡性程度有關。Meng等[5]發現，miR-125b-2-3p腎透明細胞癌預后有關，并且能夠通過EGR1促進腫瘤轉移。Zeng等[6]發現，lncRNA XIST/miR-125b-2-3p軸能夠調節結腸癌的細胞增殖和化療敏感度。我們通過生物信息技術分析GEO GSE123336數據集，聯合我院病人血清樣本進行分析，探討血清miR-125b-2-3p與顱腦損傷病人嚴重程度和預后的關系。

材料與方法

1.公開數據庫:(1)GEO數據庫:本研究使用GEO數據集GSE123336對顱腦損傷血清miRNA進行篩選，該數據集包含了綜合格斗(Mixed Martial Arts，MMA)頭部擊打次數，比賽前、比賽后不同時間的血清miRNA測序結果[7]，因此，這一部分數據是配對數據。由于該數據集中樣本比較復雜，包含唾液和血清的測序結果。本研究不涉及唾液miRNA表達量，只選用了該數據集中的部分數據。納入共計34個參賽者，僅分析比賽前、比賽后當天的血清數據。(2)mirPATH數據庫:為了研究差異miRNA可能的機制，本研究選用mirPATH數據庫對8個差異miRNA進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)聚類分析[8]。初步判斷差異miRNA可能涉及的功能通路。

2.臨床樣本：本研究收集以下病人血清：閉合性顱腦損傷輕型、中型、重型、特重型。納入標準：(1)符合主要診斷，除腦外傷以外無其他臟器外傷破裂；(2)年齡18～85周歲；(3)無嚴重慢性疾病病史；(4)頭部創傷6小時內；(5)無長期用藥史；(6)既往無精神、智力異常；(7)無嚴重胸腹部外傷。由于閉合性顱腦損傷輕型發病率高，樣本量龐大，本研究中并不需要納入所有的輕癥病人。因此只涉及2021年4月1日～2021年4月30日期間的閉合性顱腦損傷輕型的非手術病人，共27例。閉合性顱腦損傷(中型、重型、特重型)收集的病例為2020年6月1日～2021年4月30日間接受血腫清除術的病人，共61例。我院共納入病人88例，其中男65例，女23例。閉合性顱腦損傷輕型27例，中型13例，重型42例，特重型6例。男性病人的miR-125b-2-3p表達量為2.26±0.94，女性病人為2.02±0.96，差異無統計學意義(表1)?；€資料中格拉斯哥昏迷評分(GCS)、格拉斯哥預后評分(GOS)、住院時間與性別比較，差異無統計學意義。見表1。

表1 樣本基線資料

二、方法

1.病人入院后急診采血時順便采集血樣3 ml，置于無抗凝成分的采血管。靜置于4 ℃冰箱1小時血樣凝固后，在4 ℃，2 000轉/分鐘條件下離心15分鐘，將血清和細胞成分分裝進兩個凍存管。將凍存管編號后凍存進-80 ℃冰箱中。

2.qRT-PCR：miRNA使用血清/血漿 miRNA提取分離試劑盒從血清中提取。每份血清樣品取200 μl，提miRNA前加入cel-miR-39-3p 標準品1 μl用作外參。cel-miR-39-3p Standard RNA(miRB0000010-3-1)購自廣州銳博生物技術有限公司。逆轉錄PCR反應使用Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit，在Icycling GT9612 PCR儀進行逆轉錄，在QuantStudio3儀器進行熒光定量PCR。目標引物使用銳博公司的Bulge-Loop miR-125b-2-3p Primer Set(MQPS0000513-1-100)。外參引物使用Bulge-Loop cel-miR-39-3p Primer Set。miRNA提取、逆轉錄和qRT-PCR反應步驟遵循試劑盒說明書。

3.數據庫分析流程：下載數據后首先清理平均表達量≤10的miRNA，表達量過低的miRNA受到測量誤差的影響較大，導致差異是隨機出現的。用R語言limma包進行差異分析，差異miRNA的篩選條件為|log2FC|≥1，P≤0.001。用mirPATH數據庫對差異miRNA進行KEGG聚類分析，初步判斷差異miRNA可能涉及的功能通路。用mirPATH提供的miRNA-mRNA相互作用數據繪制互作網絡。判斷差異miRNA主要互作蛋白。

三、統計學分析

結果

1.GSE123336顯示miR-125b-2-3p在顱腦創傷組血清含量顯著上升：我們對GSE123336進行差異分析，設置篩選條件為|log2FC|≥1，P≤0.001。顯著差異的miRNA一共8個(圖1A)，其中顯著性最高的3個miRNA見表2。由于miR-125b-2-3p在數據庫中的顯著性要高于miR-10b-5p。因此，我們選擇miR-125b-2-3p進行進一步研究。使用mirPATH數據庫對8個差異進行KEGG富集分析后發現，差異miRNA功能主要富集在以下通路(圖1B)：Renal cell carcinoma,Glycosphingolipid biosynthesis,Proteoglycans in cancer,Ubiquitin mediated proteolysis,TGF-beta signaling pathway,MAPK signaling pathway,Mucin type O-Glycan biosynthesis,Sphingolipid signaling pathway,Non-small cell lung cancer。將miR-125b-2-3p和富集分析中的互作基因提取出來構建互作網絡(圖1C)。

A:GEO數據集 GSE123336差異基因熱圖。B:mirPATH數據庫對差異miRNA的富集分析結果。C:mirPATH富集分析中涉及的蛋白與miR-125b-2-3p互作網絡。黃色MAPK信號通路，藍色Sphingolipid(鞘磷脂類)信號通路，其他顏色表示其他通路

表2 Top3顯著的miRNA

2.miR-125b-2-3p隨著顱腦損傷嚴重程度顯著上調：閉合性顱腦損傷輕型病人miR-125-2-3p表達量1.02±0.36，中型病人為2.23±0.53，重型病人為3.33±0.90，特重型為3.74±1.06(圖2A)。相關性分析提示，miR-125b-2-3p與GCS評分呈現顯著負相關，差異有統計學意義(P<0.05)。

A．顱腦損傷嚴重程度與miR-125b-2-3p的關系：單因素方差分析(P<0.05)，兩兩比較除重型和特重型之間無顯著差異，其他各組兩兩比較均存在顯著差異(P<0.05)。B.miR-125b-2-3p血清表達量和GCS評分的相關性分析miR125b-2-3p表達量和損傷嚴重程度的關系

3.高表達的miR-125b-2-3p預示著不良的預后：我們分析了不同GOS預后分級的miR-125b-2-3p表達量。結果顯示，GOS Ⅰ/Ⅱ級miR-125b-2-3p相對表達量為4.12±0.74，Ⅲ級為為3.45±0.51，Ⅳ級為為2.40±0.66，Ⅴ級為為1.34±0.71(圖3A)。越高的miR-125b-2-3p表達顯預示著越差的預后(圖3A)。以GOS Ⅰ/Ⅱ級為陽性事件，以GOS Ⅲ/Ⅳ級為陰性事件進行的ROC分析，ROC曲線下面積等于0.89(圖3B)。這意味著miR-125b-2-3p對不良預后(GOS Ⅰ/Ⅱ級)有著較高的預測效能。

A.血清miR-125b-2-3p表達量與GOS預后分級的關系。B.ROC分析圖3 miR-125b-2-3p和GOS預后的關系

討論

顱腦損傷除了對外傷血腫壓迫的早期手術治療有明確療效外，并不存在特效的治療方法。重度顱腦損傷病人有相當比例的病人預后屬于GOS Ⅰ級、Ⅱ級。病人預后GOS Ⅱ級實際上會比GOS Ⅰ級給家庭帶來更大的負擔。

2015年瑞典開展一項涉及182例顱腦損傷病人的研究，該研究指出，血清NF-L可以評估6～12個月的TBI預后，是GOS預后的獨立因子[9]。李煥良等[10]研究顯示，TC、LDL-C、HbA1c和空腹血糖水平是影響顱腦損傷病人預后的危險因素。類似的，血清UCH-L1可以預測輕中度顱腦損傷病人是否需要神經外科干預[11]。第二天的血清UCH-L1 濃度預示著不良預后。

生物信息技術是發現潛在分子機制的有效手段。戴嘉婧等[12]通過生物信息技術發現，與三陰性乳腺癌發生發展有關的潛在調控軸：hsa_circ_0001361/miR-93-3p/UBE2G2和hsa_circ_0002874/miR-2115-5p/DTX3L。我們對GEO GSE123336數據集進行生物信息挖掘。該研究包含了MMA比賽頭部擊打次數和血清miRNA測序的結果。對該數據集進行分析后我們找到top 3個最顯著的差異miRNA：miR-125b-2-3p、miR-10b-5p、miR-99b-5p。而miR-125b-2-3p差異分析的P值最顯著。本研究把重點放在miR-125b-2-3p。結果顯示，血清miR-125b-2-3p在頭部外傷后顯著增加。進一步分析發現，miR-125b-2-3p和其他差異miRNA共同富集到以下通路：Renal cell carcinoma Glycosphingolipid biosynthesis,Proteoglycans in cancer,Ubiquitin mediated proteolysis,TGF-beta signaling pathway,MAPK signaling pathway,Mucin type O-Glycan biosynthesis,Sphingolipid signaling pathway,Non-small cell lung cancer。富集的通路中與miR-125b-2-3p互作的蛋白主要涉及MAPK通路和Sphingolipid(鞘磷脂類)信號通路；而MAPK通路與缺血再灌注損傷、炎癥損傷有明確關系[13-14]。Sphingolipid信號影響細胞結局和免疫應答[15]。血清miR-125b-2-3p的表達量改變可能是由于顱腦損傷后腦細胞內miR-125b-2-3p入血。而在腦細胞內失調的miR-125b-2-3p可能影響病人最終結局。

血清miR-125b-2-3p的表達量隨著顱腦損傷嚴重程度的增加顯著增加(P<0.05)。但在重型和特重型無顯著差異，這可能是由于特重型病人樣本量不足導致。相關性分析發現GCS評分和miR-125b-2-3p呈顯著負相關，P<0.05。進一步分析發現隨著GOS預后分級的增高，miR-125b-2-3p顯著降低。GOS預后分級等級越高表明預后越好。因此我們可以得出結論，血清miR-125b-2-3p是潛在的顱腦外傷預后標志物。為了判斷預測效能，我們進行了ROC分析。結果顯示，miR-125b-2-3p對GOS Ⅰ/Ⅱ級的ROC曲線下面積達到0.89。預測效能較好。

黎入熒[16]的一項研究成果顯示，腦梗死病人外泌體源性miR-125b-2-3p表達量對腦梗死有較好的診斷效能。該研究發現，在腦梗死病人中外泌體源性miR-125b-2-3p在血漿中表達顯著上調。這與我們的研究相符合，但黎入熒[16]發現，外泌體miR-125b-2-3p表達水平與神經功能缺損嚴重程度無關，與腦梗死嚴重程度無關，這與我們研究趨勢不相符合。可能的原因是黎入熒檢測的是血清外泌體，而我們的研究并未局限在外泌體。另外，顱腦損傷miR-125b-2-3p釋放機制可能與腦梗死不同，損傷可能更傾向于細胞損傷后直接釋放入血。有研究指出，血清miR-125b-5p表達水平在急性缺血性腦卒中病人中明顯升高,且與Hcy、Hs-CRP及MMP-9水平相關[17]。miR-125b-5p和miR-125b-2-3p是不同的miR-125b成熟體，現有的研究成果表明，在中樞疾患中，miR-125b家族的表達量受到影響。miR-125b-2-3p在顱腦損傷中屬于較新穎的發現。

本研究結果提示，血清miR-125b-2-3p表達量是潛在的閉合性顱腦損傷病人預后標志物。較高的血清miR-125b-2-3p表達量預示著不良預后。