紫蘇不同組織中內生芽胞桿菌的多樣性與分布特性研究

林 霞，陳 崢，劉 波*，陳梅春，林恩泉

(1.福建農林大學金山學院， 福建 福州 350002； 2福建省農業科學院農業生物資源研究所， 福建 福州 350003)

植物內生菌Endophytes指與植物達到共生、寄生、腐生等關系，且在植物的整個生命過程中無明顯負面影響的一類微生物[1]。內生菌在植物中普遍地分布[2]，并幾乎存在于植物的所有組織中[3]。植物內生菌作為一種新的微生物資源，具有增加宿主對環境應激耐受性、促進宿主植物的生長和活性成分合成等作用，具有廣闊的開發應用前景[2]。

紫蘇Perillafrutescens是我國傳統重要的藥用、食用和油料作物[4-5]，也是衛生部首批公布的藥食兼用植物之一。該植物具有抑菌、抗敏和抗氧化等重要生物特性，廣泛應用在醫學、食品與農業等領域，紫蘇能防治感冒咳嗽，具有增強機體免疫和抑制癌癥發生等功效[6-7]，在食品上用作天然防腐劑[8]等。目前關于紫蘇的有效成分、藥理、藥效的研究報道較多，對紫蘇內生菌的研究主要集中在內生真菌及其化學成分等[9-10]方面，如紫蘇內生真菌Aspergillussp.12Y03[9]與Penicilliumsp.12Y25[10]。而國內外尚少見有關紫蘇內生細菌的報道。

為了解紫蘇內生芽胞桿菌的多樣性和分布特性，本研究采用可培養法從紫蘇根、莖、葉中分離內生芽胞桿菌，運用16S rRNA基因序列進行同源性比對，采用多樣性指數與聚類分析進行統計，研究紫蘇內生芽胞桿菌的系統發育，探討芽胞桿菌種類分布特征與宿主植物的相關性，為植物-微生物的相互作用提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試植物 新鮮健康的紫蘇于2022年3月采集自浙江衢州。采集時保持整棵植株的完整性，帶回實驗室后盡快處理。

1.1.2培養基 固體培養基、液體培養基均采用LB培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1紫蘇內生芽胞桿菌的分離 內生細菌的分離參考鄭榕等[11]的方法，紫蘇植株去除泥沙雜質后，用無菌水沖洗后，分別稱取紫蘇根部、莖部和葉部各1 g，用75%乙醇與1%次氯酸鈉處理后，以無菌水沖洗3次，最后1次的沖洗液涂板檢驗植株表面是否消毒徹底。將漂洗后植物組織樣本研磨后取1 mL汁液，于超凈臺中將樣品用無菌水稀釋為原來的10-1濃度，在80℃的水浴鍋中加熱10 min后，稀釋至10-2、10-3、10-4，取不同濃度0.1 mL的樣品涂布在LB平板上，每個梯度重復3次，30℃恒溫箱內培養2 d。挑取形態不同的菌落進行劃線、純化、培養，獲得的單菌落用-80℃甘油冷凍保藏。

1.2.2紫蘇內生芽胞桿菌DNA提取和16S rRNA基因擴增 芽胞桿菌的DNA提取采用酚氯仿法提取，采用16S rRNA基因通用引物27F:5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 和1492R:5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，進行PCR擴增，PCR反應程序參照鄭雪芳等[12]的方法，PCR產物送至鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。

1.2.3紫蘇內生芽胞桿菌16S RRNA基因系統發育樹的構建 將紫蘇內生芽胞桿菌的16S rRNA基因序列上傳至EzBioCloud，與已知模式菌株的序列進行序列同源性比對，初步判斷菌株的分類地位。基因系統發育樹的構建參考劉國紅等[13]的方法，運用MEGA 7軟件分析序列，采用Neighbor-Joining方法推斷進化史，進化距離借助p-distance發進行計算。

2 結果與分析

2.1 紫蘇內生細菌的分離

對紫蘇根、莖、葉中的內生菌進行分離，根據菌落形態挑取單菌落進行純化，共分離到內生細菌19株，菌株編號見表1。從紫蘇根部中分離到的菌株數量最多，為11株(編號為FJAT-55199～55209)，從莖、葉中分離到的菌株數量較少，均為4株，莖部的內生菌編號為FJAT-55210～55213，葉部內生菌編號為FJAT-55214～55217。

表1 紫蘇不同組織樣本中分離的內生細菌

2.2 紫蘇內生芽胞桿菌的16S rRNA鑒定

分離到的19株內生細菌16S rRNA基因測序鑒定結果見表2，分離菌株歸屬于芽胞桿菌科Bacillaceae的4個屬，分別為虛構芽胞桿菌屬Fictibacillus、芽胞桿菌屬Bacillus、普里斯特氏菌屬Priestia和Niallia。其中，虛構芽胞桿菌屬Fictibacillus有2個種，為奇異虛構芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus、國化室虛構芽胞桿菌Fictibacillusenclensis；芽胞桿菌屬Bacillus有6個種，分別為高地芽胞桿菌Bacillusaltitudinis、假蕈狀芽胞桿菌Bacilluspseudomycoides、貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis、沙福芽胞桿菌Bacillussafensis、蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus、副蕈狀芽胞桿菌Bacillusparamycoides；Niallia有1個種，為環狀芽胞桿菌Nialliacirculans；普里斯特氏菌屬Priestia有2個種，為阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai、巨大普利斯特菌Priestiamegaterium。

表2 基于16S rRNA基因的芽胞桿菌種類鑒定

2.3 紫蘇內生芽胞桿菌的系統發育分析

以19株紫蘇內生芽胞桿菌及13株同源菌株的16S rRNA序列為樣本，采用Neighbour-Joining方法，構建紫蘇內生芽胞桿菌的系統發育樹(圖1)。結果表明，紫蘇內生菌主要分為A、B、C、D 4個類群。類群A主要包括了6株菌(FJAT-55200、FJAT-55204、FJAT-55205、FJAT-55207、FJAT-55208、FJAT-55216)，其中5株分離自根部，1株分離自葉部，與Niallia和普里斯特氏菌屬Priestia的親緣關系較近；類群B則包括3株菌(FJAT-55199、FJAT-55210、FJAT-55211)，分離自根部和莖部，與虛構芽胞桿菌屬Fictibacillus的親緣關系較近，其中FJAT-55199、FJAT-55211與Fictibacillusbarbaricus聚為一類，而FJAT-55210與Fictibacillusenclensis聚為一類；類群C包括6株菌(FJAT-55201、FJAT-55202、FJAT-55206、FJAT-55209、FJAT-55212、FJAT-55214)，分離自根部、莖部和葉部；與芽胞桿菌屬的Bacillusaltitudinis、Bacillussafensis和Bacillusvelezensis親緣關系較近；類群D包括4株菌(FJAT-55203、FJAT-55213、FJAT-55215、FJAT-55217)，分離自根部、莖部和葉部，與芽胞桿菌屬的Bacilluscereus、Bacilluspseudomycoides和Bacillusparamycoides具有較近的親緣關系。

圖1 基于16S rRNA基因序列的內生芽胞桿菌系統發育分析

2.4 紫蘇不同組織內生芽胞桿菌的分布

由表3可知，芽胞桿菌在紫蘇的根、莖、葉中都有分布，呈現出種類和數量上的差異。7種內生芽胞桿菌僅存在于植物單一組織中，如國化室虛構芽胞桿菌Fictibacillusenclensis，只在莖中分離到；而副蕈狀芽胞桿菌Bacillusparamycoides僅存在于葉部中，紫蘇則根部分布了較多獨特的芽胞桿菌種類，包括了貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis、高地芽胞桿菌Bacillusaltitudinis、假蕈狀芽胞桿菌Bacilluspseudomycoides、環狀芽胞桿菌Nialliacirculans和巨大普利斯特菌Priestiamegaterium。另外，有4種內生芽胞桿菌在不同組織中同時被分離到，其中奇異虛構芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus同時存在于根部和莖部，阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai同時存在于根部和葉部，而沙福芽胞桿菌Bacillussafensis和蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus則同時存在于葉部和莖部。

表3 內生芽胞桿菌在紫蘇植株中的分布

以芽胞桿菌在不同組織內的分布種類為樣本，數據經標準化轉化后進行聚類，結果見圖2。當歐氏距離為3.63時，11種內生芽胞桿菌可以分為3類。第1類包括5個菌：巨大普利斯特菌Priestiamegaterium、環狀芽胞桿菌Nialliacirculans、假蕈狀芽胞桿菌Bacilluspseudomycoides、高地芽胞桿菌Bacillusaltitudinis和貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis，5種芽胞桿菌均只分布在紫蘇的根部組織中；第2類包括2個菌：阿氏芽胞桿Priestiaaryabhattai和副蕈狀芽胞桿菌Bacillusparamycoides，只存在于葉部組織中；第3類包括4個菌：分別為蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus、沙福芽胞桿菌Bacillussafensis、奇異虛構芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus、國化室虛構芽胞桿菌Fictibacillusenclensis，特征為在莖部組織內分布，其中國化室虛構芽胞桿菌Fictibacillusenclensis)單獨分布在植物的莖中，而奇異虛構芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus同時存在于植物的根、莖中，蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus、沙福芽胞桿菌Bacillussafensis同時存在莖部和葉部中。

圖2 以種類為樣本的芽胞桿菌聚類分析

2.5 紫蘇內生芽胞桿菌的多樣性分析

利用表2為矩陣，以紫蘇不同組織為樣本，芽胞桿菌種類為指標，對紫蘇內生芽胞桿菌多樣性進行分析表明，紫蘇根部的Shannon多樣性指數(1.7987)均高于莖部(1.3863)和葉部(1.3863)，在豐富度方面，根部的豐富度(2.5022)也高于莖部(2.1640)和葉部(2.1640)。

表4 芽胞桿菌種類在紫蘇中的分布情況

3 討論

在農業微生物領域，內生菌能產生多樣的活性物質，且與宿主植物關系密切，更有利于生防作用的發揮[14]，在植物病害生物防治中具有巨大應用潛力[14-15]。芽胞桿菌是一類重要的植物內生菌，廣泛地分布在多種植物的多個組織中[11]。本研究從紫蘇根、莖、葉中分離到的內生菌，經16S rRNA基因測序鑒定，歸屬于芽胞桿菌科Bacillaceae的4個屬，11個種。紫蘇不同組織中含有豐富的內生芽胞桿菌種類，包括了奇異虛構芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus、國化室虛構芽胞桿菌Fictibacillusenclensis、為高地芽胞桿菌Bacillusaltitudinis、假蕈狀芽胞桿菌Bacilluspseudomycoides、貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis、沙福芽胞桿菌Bacillussafensis、蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus、副蕈狀芽胞桿菌Bacillusparamycoides、環狀芽胞桿菌Nialliacirculans、阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai和巨大普利斯特菌Priestiamegaterium。本研究探明紫蘇內生芽胞桿菌種類的同時，也豐富了植物組織內部這種極端環境下的芽胞桿菌分布蹤跡。

植物內生菌在宿主植物組織中的分布規律是內生菌對外界適應的重要機制，菌體及其代謝產物能對調控植株生長發育以及環境脅迫適應等方面產生重要影響[16]。同時，細菌多樣性對揭示細菌種群結構功能及其與生存環境的相關性至關重要[13]。本研究分析了紫蘇內生芽胞桿菌在植物體內的多樣性和分布特征。芽胞桿菌在紫蘇的根、莖、葉中都有分布，呈現出種類和數量上的差異。4種內生芽胞桿菌在不同組織中同時存在，包括了奇異虛構芽胞桿菌Fictibacillusbarbaricus同時存在于根部和莖部；阿氏普利斯特菌Priestiaaryabhattai同時存在于根部和葉部；而沙福芽胞桿菌Bacillussafensis和蠟樣芽胞桿菌Bacilluscereus則同時存在于葉部和莖部，剩余的7種芽胞桿菌只存在于植物的單一組織中。在內生菌分布多樣性方面，紫蘇根部的Shannon多樣性指數(1.798 7)均高于莖部(1.386 3)和葉部(1.386 3)，在豐富度方面，根部的豐富度(2.502 2)也高于莖(2.164 0)和葉(2.164 0)。鄭榕等[11]研究表明藥用植物夏枯草Prunellavulgaris根部組織內生芽胞桿菌，在種類和數量都高于莖、葉部組織，芽胞桿菌在植株體內的分布規律與本研究的結果相似。

藥用植物及其生境中的微生物關系密切，相互影響，相互作用，形成了植物-微生物共生體系，成為近來藥用植物研究熱點[17]。本文通過對紫蘇內生菌的多樣性和分布特性分析，探明了紫蘇內生芽胞桿菌資源，也為研究內生芽胞桿菌與宿主植物的相關性提供了基礎和依據。