復方紫草陰道用微乳-原位凝膠的制備與評價*

趙玉娜，劉青，何艷萍，高婷，陳晶

(寧夏醫科大學總醫院制劑中心，銀川 750004)

復方紫草油為我院自制制劑，處方由紫草、白芷、當歸、冰片等藥材組成，具有清熱涼血、解毒止痛等功效[1]，除可抗菌消炎外還有生肌和促進上皮生長功能，其止痛效果好，創面愈合快，用于婦科陰道炎、宮頸糜爛等疾病治愈率高，療效確切，陰道不適癥狀可得到明顯改善，且不影響宮頸彈性，具有良好的臨床應用前景[2]。

臨床使用復方紫草油時，將油制劑制備成含藥紗條，將紗條填入患者陰道，使其緊貼宮頸糜爛面，30 min后取出或留出尾端于陰道口外，囑患者睡前取出。該藥存在患者自主給藥困難、使用時有異物感、給藥次數頻繁、患者順應性差等缺點，因此有必要將其制備成陰道黏膜給藥制劑。溫度敏感型原位凝膠是一類以溶液給藥、在生理條件下轉化為非化學交聯半固體的制劑，其基質常選用泊洛沙姆407(Poloxamer 407，P407)和泊洛沙姆188(Poloxamer 188，P188)[3]，其在低溫時呈低黏度流體狀態，置入陰道后，在體溫條件下與多褶皺的陰道黏膜組織緊密貼合，并迅速轉變為半固體凝膠，可增強藥物生物粘附性、延長藥物滯留時間并提高生物利用度[4-5]。筆者在本實驗將復方紫草油制備成溫度敏感型微乳-原位凝膠，并對其性狀、粒徑、流變學性質、體外釋放度等進行研究，以期為該制劑用藥研究提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(Waters 2489紫外檢測器，1525泵)；MS105DU 型分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.01 mg)；THZ-D恒溫振蕩器(蘇州培英實驗設備有限公司)；TGL-16C臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；79-1磁力加熱攪拌器(江蘇江陰科研器械廠)；ST2100 pH計(常州奧豪斯儀器有限公司)；Malvern Nano ZS-90型粒度電位儀(英國馬爾文儀器有限公司)；H-7650透射電子顯微鏡(日本日立)。

1.2試劑 左旋紫草素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110769-200506，含量：99.8%)；復方紫草干浸膏(本實驗室自制，左旋紫草素含量1.72 mg·g-1)；P407(批號：GND11321B) 、P188(批號：GND10221B)、聚氧乙烯-35-蓖麻油(EL-35，批號：95284497V0)、肉豆蔻酸異丙酯(IPM，批號：00018999798)均來自德國BASF公司；丙三醇(批號：20190401)、磷酸(批號：20170801)來自天津市大茂化學試劑廠；甲醇(美國Fisher chemical公司，色譜純，批號：190291)。

2 方法與結果

2.1復方紫草微乳處方的篩選與確定

2.1.1微乳油相、乳化劑和助乳化劑的篩選 將足量干浸膏分別加入含有2 mL不同溶媒的具塞試管，置渦旋振蕩器渦旋10 min，充分混勻，置(37±1) ℃恒溫振蕩器振蕩72 h至達到溶解平衡；將混合物5000 r·min-1離心15 min，孔徑0.45 μm微孔濾膜過濾；取續濾液，采用高效液相色譜(HPLC)法檢測指標成分左旋紫草素峰面積，計算其在不同組分中的溶解度，篩選增溶效果較好的油相、乳化劑和助乳化劑[5-6]。結果見表1。

表1 左旋紫草素在不同組分中的溶解度測定結果

結果表明，左旋紫草素在油相IPM、乳化劑EL-35和助乳化劑丙三醇中的溶解度較大，故本實驗選擇IPM、EL-35和丙三醇分別作為油相、乳化劑和助乳化劑，通過繪制偽三元相圖確定微乳各相比例。

2.1.2微乳各相比例的確定[7-8]將乳化劑與助乳化劑分別以質量比(即Km值)3：1，2：1，1：1 混合均勻，制成混合溶液。將混合溶液與油相按質量比9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，4：6，3：7，2：8，1：9的比例混勻，在持續磁力攪拌條件下，緩慢滴加超純水，直至體系平衡形成澄清透明微乳，記錄此時加水量。計算臨界點油相、混合表面活性劑及水相在微乳體系中的質量分數，借助Origin 8.5版軟件繪制微乳偽三元相圖，并選擇適宜Km值。復方紫草微乳偽三元相圖見圖1。

圖1 不同乳化劑和助乳化劑比例微乳的偽三元相圖

當Km值為3：1時，微乳區域面積較大，從相圖中選擇微乳的組成為油相(12.5%，W/W)，乳化劑系統(37.5%，W/W)和純化水(50%，W/W)，并確定Km值為3：1。

2.1.3復方紫草微乳的制備 稱取復方紫草干浸膏2.0 g，置4.0 g IPM中超聲加速溶解，取混合乳化劑(EL-35 9.0 g和丙三醇3.0 g)加入上述油相，室溫下磁力攪拌混合均勻，緩慢滴加超純水至100.0 g，使成澄清透明液體，制成微乳。依此重復制備微乳液3批[9]。

2.2復方紫草微乳-原位凝膠的制備[10]P407溶液在達到臨界膠束濃度和溫度后，親水性聚氧乙烯(PEO)段和疏水性聚氧丙烯(PPO)段相互作用，緊密堆砌纏繞形成半固體凝膠，在P407中加入適量P188，可調節PEO/PPO比例，達到理想膠凝溫度[11]，使凝膠液能夠在30 ℃內保持液態，且經模擬陰道液[12-13]稀釋后的凝膠在約34 ℃時，形成半固體態凝膠。

采用冷溶法[14]制備復方紫草陰道用微乳-原位凝膠。取制備好的微乳，加入處方量P407和P188，充分攪拌后置4 ℃冰箱溶脹24 h，取出該微乳-原位凝膠液，緩慢攪拌使分散均勻，陰道用制劑pH值應為4.0～5.5[15]，故使用稀鹽酸調節凝膠液pH值至該范圍，即得復方紫草微乳-原位凝膠液。

健康女性陰道內溫度37.2～37.8 ℃，理想溫敏凝膠應在尚未達到體溫條件下即迅速成膠[16]，故期望本制劑膠凝溫度約為34 ℃。通過多次預實驗并結合文獻[7，9]可知，微乳中含有表面活性劑和油相，會影響分子物理聚集和纏結，達到理想膠凝溫度時，凝膠基質濃度顯著降低。當P407和P188濃度分別為100和20 mg·mL-1時，制備的微乳凝膠經模擬陰道液稀釋后，膠凝溫度為34.5 ℃。推斷復方紫草微乳-原位凝膠具有溫度敏感性，可在陰道環境下膠凝為半固體凝膠。

2.3復方紫草微乳-原位凝膠中左旋紫草素含量測定方法的建立

2.3.1色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸(85：15)；檢測波長：516 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.3.2供試品及對照品溶液的制備與測定 取復方紫草微乳-原位凝膠，精密稱取5.0 g于25 mL量瓶，加適量甲醇，超聲處理10 min使破乳，冷卻至室溫，甲醇定容，搖勻，取溶液適量至離心管，5000 r·min-1離心15 min后取上清液，經孔徑0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，作為供試品溶液。以左旋紫草素為對照品，精密稱取對照品10 mg于100 mL量瓶，加適量甲醇使藥物溶解并定容，搖勻，作為儲備液。精密移取1 mL于10 mL量瓶，加甲醇稀釋并定容，作為對照品溶液。按“2.3.1”項色譜條件進行測定，記錄峰面積，以外標法計算含量。

2.3.3方法學驗證 專屬性考察：分別取空白凝膠溶液、對照品溶液和供試品溶液按“2.3.1”項色譜條件進樣，記錄色譜圖，空白凝膠、左旋紫草素對照品溶液、復方紫草微乳-原位凝膠的色譜圖見圖2。結果表明，左旋紫草素與雜質峰分離良好，雜質峰對測定結果無干擾。該方法準確可靠，適用于藥物含量測定及釋放行為的考察。

線性范圍：精密配制系列濃度為 2～30 μg·mL-1左旋紫草素溶液，作為標準溶液。按照“2.3.1”項色譜條件測定，記錄峰面積。以左旋紫草素峰面積(A)為縱坐標、濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸得標準曲線方程。回歸方程A=29 617C-2 941.2，r=0.999 9。結果表明，左旋紫草素在2～30 μg·mL-1范圍內，濃度與峰面積呈良好線性關系。

精密度：取10 μg·mL-1左旋紫草素溶液，按照“2.3.1”項色譜條件連續測定6次，記錄峰面積，考察方法精密度。結果表明，左旋紫草素對照品溶液，重復進樣的RSD為0.83%(n=6)，該方法精密度良好。

回收率實驗：精密稱定已知含量的凝膠樣品6份，分別加入一定量左旋紫草素對照品溶液，按“2.3.2”項供試品處理方法處理上述樣品，依“2.3.1”項色譜條件測定峰面積，并計算回收率。平均回收率98.84%，RSD1.14%，表明該方法準確度良好。

A.空白凝膠；B.左旋紫草素對照品；C.復方紫草微乳-原位凝膠；1.左旋紫草素。

溶液穩定性：按照“2.3.2”項方法配制供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8 h進樣，記錄色譜峰面積，并求算RSD，考察樣品溶液穩定性。結果表明，供試品溶液室溫放置8 h內，左旋紫草素含量無顯著變化，RSD為1.37%。

2.3.4樣品中左旋紫草素的含量測定 在復方紫草微乳-原位凝膠的最佳處方與工藝條件下，分別制備3批樣品(批號：200615，200616，200618)，按照含量測定方法，每批樣品測定3次，計算其平均含量。3批凝膠中左旋紫草素的含量分別為75.30，73.52和74.69 μg·mL-1，RSD為1.21%(n=3)。

2.4復方紫草微乳-原位凝膠的理化性質評價

2.4.1外觀性狀 按照微乳和微乳-原位凝膠優化條件，分別制備復方紫草微乳和微乳-原位凝膠，并對微乳、未膠凝的凝膠液與膠凝后凝膠外觀形態進行觀察。

復方紫草微乳液為澄清透明紫紅色溶液，流動性良好，經10 000 r·min-1離心10 min后穩定不分層；微乳-原位凝膠在25 ℃時為紫紅色且具一定流動性的液體；34 ℃膠凝后微乳-原位凝膠呈紫紅色半固體態(圖3)。

圖3 復方紫草微乳(A)與微乳-原位凝膠膠凝前后(B、C)外觀圖

2.4.2粒徑與形態測定 取復方紫草微乳和微乳-原位凝膠液，經適量純化水稀釋后于Malvern Nano ZS-90型粒度電位儀平行測定3次，計算平均粒徑和粒徑分布指數，并測定其Zeta電位。采用透射電鏡觀察微乳和微乳-原位凝膠在膠凝前后的形態。

復方紫草微乳和微乳-原位凝膠的平均粒徑分別為(21.95±0.64)和(23.23±0.29) nm(n=3)，粒徑分布指數分別為0.119±0.97和0.190±0.82(n=3)，其粒徑分布較集中，且凝膠基質加入對微乳粒徑影響較小(圖4)。微乳Zeta電位為(-14.44±2.64) mV，表明微乳較穩定。

圖4 復方紫草微乳(A)與微乳-原位凝膠(B)粒徑分布圖

利用透射電鏡觀察復方紫草微乳和微乳-原位凝膠發生膠凝前后的形態特征(圖5)。由圖5可知，微乳及膠凝前后的凝膠中，乳滴均呈規則均勻的類球形，粒徑較小，且分散性良好，無粘連。

圖5 復方紫草微乳(A)、未膠凝(B)與膠凝(C)微乳-原位凝膠透射電鏡掃描圖

2.4.3黏度和流變學特性考察 將復方紫草微乳凝膠液與模擬陰道液按40：7.5比例混合[17]，采用流變儀，測定非生理條件(25±0.1) ℃和生理條件(35±0.1) ℃下凝膠在不同剪切速率下對應的表觀黏度值。微乳-原位凝膠經模擬陰道液稀釋后的膠凝溫度為34.5 ℃。在非生理條件下，凝膠液黏度值很小，且隨剪切速率變化不大；而在模擬生理條件下形成凝膠后，凝膠呈剪切速率依賴性，隨剪切速率的增大，表現出剪切變稀的假塑性，呈非牛頓流體特性。

2.5凝膠的體外釋放研究 采用無膜溶出法[14，18]，將復方紫草微乳原位凝膠液10 mL加入已稱重的平底帶塞西林瓶，置37 ℃恒溫振蕩器，待其完全膠凝，加入37 ℃預熱的模擬陰道液5 mL，作為釋放介質，100 r·min-1振蕩，每30 min后立刻傾出全部釋放介質，并迅速稱量此時西林瓶的質量，然后將西林瓶重新放入振蕩器，并補充等溫釋放介質5 mL，反復操作至剩余凝膠量約為總量10%。溶出樣品液經孔徑0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液照“2.3.1”項色譜條件進樣分析，以藥物累積釋放量對時間作圖，得藥物釋放曲線，并按下式計算藥物累計釋放百分率。

Cn和Ci分別為第n個和第i個取樣點測得的藥物濃度(μg·mL-1)；A為凝膠中藥物總量(μg)。復方紫草微乳凝膠的藥物累積釋放曲線結果見圖6。

圖6 復方紫草微乳-原位凝膠累積釋放曲線

采用DDsolver軟件分別用零級、一級動力學及Higuchi方程對凝膠的體外釋放曲線進行模型擬合，結果見表2。

表2 復方紫草微乳-原位凝膠體外釋藥的模型擬合

由方程R2值可知，復方紫草微乳-原位凝膠的藥物釋放曲線與零級動力學方程擬合較好，藥物釋放行為符合零級動力學方程，凝膠溶蝕是控制藥物釋放的主要因素，復方紫草微乳-原位凝膠具有一定的緩釋效果。

3 討論

復方紫草油治療婦科疾病療效顯著，但傳統油制劑紗條存在用藥不便、有效成分含量較低等缺點，本研究將其制備成微乳-原位凝膠，兼有微乳和原位凝膠雙重優點。與傳統制劑相比具有無異物感、藥物分布均勻的特點，且其生物黏附性高，可延長藥物在給藥部位的滯留時間并達到緩釋效果，減少給藥次數。分別采用三元相圖和正交實驗篩選微乳及凝膠的最優處方，最終制備的復方紫草微乳-原位凝膠具有良好的理化性質。凝膠經模擬陰道液稀釋后，膠凝溫度為34.5 ℃，可推斷復方紫草微乳-原位凝膠具有溫度敏感性，在陰道環境下膠凝為半固體凝膠。該原位凝膠有較好的釋藥性能，其藥物釋放行為符合零級動力學方程。

該復方制劑中君藥為新疆紫草，其主要有效成分為萘醌類物質左旋紫草素，因此，本實驗以左旋紫草素為制劑的指標成分，對其進行含量測定，后續擬增加其他成分的含量測定，逐步完善該制劑的質量標準。復方紫草陰道用微乳-原位凝膠可直接陰道給藥，從而顯著提高患者的用藥依從性。該制劑的陰道刺激性、藥效學及藥動學特征等有待進一步研究。