納米藥物體外溶出測定方法研究進展

楊子毅，盛利娟，朱霖，林霞

(1.江南大學生命科學與健康工程學院，無錫 214000；2.江蘇諾和必拓新藥研發有限公司，無錫 214028)

隨著醫藥科學的快速發展，納米技術在臨床被廣泛用于肺部疾病[1]、皮膚病[2]、生殖醫學[3]等各領域的診斷和治療，納米藥物研究成為當今藥物研究的熱點之一。與傳統藥物遞送系統相比，納米藥物具有眾多優勢[4-5]，如改善難溶性藥物生物利用度、提高藥物體內外穩定性、將藥物靶向遞送至人體病變組織部位、提高藥物療效等。

然而，近年來納米藥物存在的安全性風險被逐漸關注。質量評價對控制納米藥物安全性和有效性至關重要。其中體外藥物溶出或釋放是評價藥物質量、監控藥物制劑設計和批次間差異的關鍵質量屬性[6]，是影響納米藥物生物利用度的基本特征之一，可在一定程度上反映納米藥物安全性、療效和質量。此外，可以根據體外藥物釋放特征模擬納米藥物體內分布，如利用數學模型建立體內外相關性，預測納米藥物體內行為，加快納米藥物上市。筆者在本文綜述不同類型納米藥物結構特點及現有溶出測定方法，以期為納米藥物開發提供參考。

1 納米藥物分類及釋藥特點

納米藥物主要包括藥物納米晶和載藥納米遞送系統兩類。納米晶是將藥物直接制備成具有納米尺度的顆粒，并制備成供臨床使用的適宜制劑；載藥納米遞送系統是將藥物以溶解、分散、吸附或包裹于適宜的載體或高分子材料中所形成的的納米粒。其中載藥納米遞送系統由于載體材料不同，制備工藝不同，其所形成的的納米藥物結構也不同，包括脂質體、聚合物膠束、納米管、納米囊/納米球、納米纖維、納米乳、納米凝膠等，結構示意圖見圖1[7]。目前已有幾十種納米藥物應用于臨床，部分已上市納米藥品及其結構類型見表1。

圖1 部分載藥納米遞送系統結構示意圖[7]

表1 部分已上市納米藥品

由于納米藥物尺寸較小、結構復雜，與其他制劑相比，影響藥物釋放的因素更復雜。如納米藥物粒度分布、結構特點、載體材料自身降解特點、藥物自身理化性質及與載體材料的相互作用、藥物在制劑結構中的微觀分布、納米藥物與體內蛋白之間的相互作用、納米載體孔徑大小、外部環境刺激、內部構象和滲透性等均可影響藥物釋放。不同納米藥物由于結構不同，影響藥物釋放的因素也有所區別。

1.1納米晶 納米晶也稱為納米混懸，其結構較簡單，由納米尺度的藥物顆粒與吸附于粒子表面的穩定劑層組成。納米晶經不同給藥途徑給藥后，藥物釋放特點及影響因素也各不相同[8]。如經口服后，藥物釋放主要受藥物理化性質、胃腸道分泌液環境影響。弱酸性藥物在胃中溶解速率較低，進入腸道后，由于腸道pH值更高，溶解度顯著增加。而弱堿性藥物在胃中快速溶解，進入十二指腸后形成過飽和溶液體系。中性藥物在胃腸道的溶出則主要依賴自身溶解速率和胃腸道分泌的增溶劑。此外，影響納米晶釋放的因素還包括物理穩定性(如聚結性和再分散性等)、與溶解和過飽和度相關的溶解性質、輔料對維持過飽和態的穩定作用等[9]。經靜脈注射后，納米晶體藥物溶出速率主要與其在血液中的溶解速率相關。此外，進入體循環后也會被巨噬細胞吞噬，富集于肝臟和脾臟。納米晶體經肌內注射后，可在注射部位誘發慢性肉芽腫炎癥反應，給藥24 h后，納米晶體被炎癥反應誘發的上皮樣巨噬細胞包裹，在巨噬細胞內，藥物緩慢溶解，達到緩釋目的[10]。

1.2載藥納米遞送系統

1.2.1脂質體 脂質體是內部為水相、由類脂質雙分子層組成的超微囊載體制劑。脂溶性藥物分散于脂質雙分子層中，如維替泊芬和紫杉醇；或是與帶有相反電荷的脂質形成復合物分散于脂質雙分子層，如兩性霉素B。親水性藥物通常以不同物理狀態被包載于內水相，如順鉑和環丙沙星以過飽和溶液形式存在；長春瑞濱和長春新堿以無定型沉淀存在；多柔比星、柔紅霉素和拓撲替康以納米晶形式存在[11]。脂質體藥物釋放主要依賴藥物滲透和擴散作用，其影響因素較復雜，包括脂質體本身理化性質、被包載藥物的物理狀態、以及外在因素如釋放介質種類及是否含有滲透性離子、溫度、pH值和酶等。影響脂質體藥物溶出的理化性質包括藥物在雙分子層的滲透性、藥物電離常數、藥物與脂質雙分子層的結合作用、藥物自聚集性和脂質體內藥物沉淀物的理化性質等。藥物分子的尺寸和橫截面積也顯著影響藥物在脂質雙分子層的滲透和擴散。此外，內水相中緩沖鹽濃度及類型、藥物/脂質比例、內水相pH值、體積等對藥物釋放也有影響。

1.2.2納米乳 納米乳可以顯著提高難溶性藥物溶解度，已被廣泛應用于難溶性藥物靜脈用注射劑及口服高效制劑的研究。其中藥物可以溶解或分散于油相，也可以分布于界面膜。其藥物釋放影響因素包括藥物與納米乳界面乳化劑的結合作用、藥物界面活性、乳滴粒徑、脂質組成、界面膜穩定性、藥物在納米乳的微觀分布。此外，納米乳在體內環境中自身結構不穩定，易被機體代謝，也會加速藥物釋放。

1.2.3基于聚合物載體的納米藥物 基于聚合物載體的納米藥物結構類型包括聚合物膠束、納米管、納米囊、納米球、納米纖維以及納米凝膠等。該類納米藥物的藥物釋放主要受以下因素影響：制劑組成(藥物、聚合物類型和其他輔料)，各組分間比例，各組分間的相互作用，聚合物降解特性和制備工藝等。藥物釋放機制主要包括擴散、溶劑交換、聚合物降解和環境響應釋放4類機制，具體見圖2[12]。

圖2 基于聚合物載體的納米藥物釋藥機制[12]

藥物擴散控制釋放在納米囊和納米球中較常見。納米囊為“核-殼”結構，溶解或分散在核心的藥物經溶解，并通過“殼”狀結構擴散釋放至體液或介質[13]。骨架型納米球中藥物通常分散于聚合物高分子材料基質，也存在擴散控制釋放機制。

溶劑交換，即在藥物釋放過程中，溶劑進入某些納米藥物結構，從而影響納米藥物中藥物釋放，包括滲透壓或溶脹控制釋放。如納米凝膠，其由具有三維網狀結構的交聯聚合物組成。納米凝膠溶脹后，藥物可經體系中溶劑通道溶解-擴散，釋放至體液或介質?？梢酝ㄟ^調整制劑中藥物分布或聚合物類型，控制藥物釋放速度。如SHEN等[14]設計了一種具有氧化還原/超聲波雙重刺激反應的新型納米凝膠系統，用于精確控制藥物釋放速度。

聚合物降解控制釋放是以生物可降解高分子材料為載體的納米藥物中藥物釋放的重要釋藥機制之一。如聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]或聚己內酯(polycaprolactone，PCL)隨著聚合物的降解，還會發生自催化降解，使骨架結構塌陷，水分進入制劑內部，藥物釋放。聚酸酐和聚原酸酯等通常發生溶蝕作用，并導致聚合物逐漸降解，藥物釋放。

環境響應型釋藥機制多應用于具有局部靶向治療作用的納米藥物中，包括pH值、離子強度、超聲、電化學或磁響應。其藥物釋放機制主要是納米藥物所處環境發生變化時，聚合物結構或溶解特性發生變化，制劑結構塌陷或瓦解，導致藥物釋放。

2 納米藥物的體外溶出測定方法

藥物體外釋放度是指藥物在規定條件下從藥物制劑中釋放的速度和程度，是納米藥物的質量控制指標之一，一定程度上反映了納米藥物的體內行為，從而確保了藥物臨床使用有效性和安全性。它可指導制劑開發并可在一定程度上預測體內吸收特點。

納米藥物體外溶出/釋放的主要測定方法包括取樣分離法、透析法、流通池法等。在藥物溶出/釋放測定方法的研究中，無論是使用已有方法還是修訂及重新建立方法，納米藥物的溶出/體外釋放測定法均應經過充分驗證，以確保方法的準確性和重現性[15]。

2.1取樣分離法 取樣分離法是將納米藥物直接分散于一定體積恒溫釋放介質，定時取樣，取樣后及時補充等量新鮮釋放介質以維持相應漏槽條件，通過測定藥物累積釋放量評估藥物釋放行為。取出的樣品可以使用過濾器分離釋放介質和納米藥物，也可以采用離心分離法，如超速離心法和離心超濾法。取樣分離法可以使用《中華人民共和國藥典》標準溶出裝置，包括槳法、籃法、小杯法等，也可以使用搖瓶法。

如ZHANG等[16]采用取樣分離法，使用水浴恒溫振蕩器研究谷胱甘肽響應型姜黃素納米膠束的體外釋放，取樣后采用超速離心法分離納米藥物和介質。該方法可以區分含有不同濃度谷胱甘肽濃度的介質，釋放速率隨谷胱甘肽濃度的增加而增加(圖3)。美國食品藥品管理局(FDA)溶出度數據庫中，阿立哌唑緩釋注射劑(Abilify Maintena?)以及兩種帕潘立酮棕櫚酸酯緩釋注射液(Invega Sustenna?和Invega Trinza?)，均使用《美國藥典》(United States Pharmacopoeia，USP)第二法槳法取樣分離法測定體外釋放度。

圖3 谷胱甘肽響應型納米膠束體外釋放曲線[16]

取樣分離法可以直接檢測藥物釋放，并可以使用《中華人民共和國藥典》規定的標準溶出設備開展，方法較簡單。但該方法也存在一定局限性，如在釋放過程中藥物可能發生聚集；取樣過程中由于納米藥物粒徑較小，易堵塞或吸附在溶出裝置的過濾系統中，取樣時也有部分藥物被取出，造成藥物損失；以上因素均影響測定結果準確性。此外，在將樣品中分散介質與納米藥物分離過程中，藥物還在繼續溶出，也影響結果的準確性。

2.2透析法 透析法是將納米藥物密封于含有釋放介質的透析袋或者透析裝置，再置于含有釋放介質的容器，利用小分子可以通過半透膜，而納米顆粒粒徑大不能透過半透膜的特點，使游離藥物擴散至釋放介質。通過直接測定透析裝置外側釋放介質中藥物濃度，評估藥物釋放速度。也可以將納米藥物使用大體積釋放介質稀釋置于容器，將含有空白釋放介質的透析袋或透析裝置置于上述容器，測定透析袋內釋放介質中藥物濃度。透析法可以使用《中華人民共和國藥典》標準溶出裝置，包括槳法、籃法、小杯法、流通池法、擴散池法等，也可以使用簡易方法如搖瓶法或燒杯攪拌法。

與取樣分離法相比，透析法可以利用透析膜分離游離藥物與納米藥物，在釋放過程中可避免反復取樣導致的藥物損失，以及取樣后繁瑣的游離藥物分離操作。目前，透析法已被廣泛應用于納米藥物體外溶出研究中[17-18]。如NAIR等[17]使用透析法研究不同粒徑(<50 nm，50～100 nm和>100 nm)苯妥英鈉脂質體體外藥物釋放，隨著粒徑增大，體外釋放速度顯著降低，可以區分不同粒徑脂質體的藥物釋放。

透析法中影響藥物釋放速度的重要因素是透析膜材質和截留分子量。透析膜材質主要有再生纖維素、纖維素酯和聚偏二氟乙烯[19]。需充分評估透析膜對藥物的吸附作用，避免釋放出的游離藥物大量吸附于透析膜表面，進而影響游離藥物向釋放介質中擴散。此外，還需系統優化透析膜截留分子量，需在滿足游離藥物擴散通過的同時，避免納米藥物中小粒徑顆粒通過或堵塞透析膜。

透析法雖然操作簡單，但在實際應用中仍然存在一定問題。如納米藥物在透析袋或透析裝置中聚集或沉降，透析袋或透析裝置形狀不固定導致釋藥表面積存在差異，在溶出裝置中位置無法固定，難溶性藥物易吸附于透析膜中，透析袋內可容納的介質體積有限、往往難以達到漏槽條件等，這均導致無法測得納米藥物真實溶出速率。

透析膜對絕大多數藥物擴散均產生一定屏障作用，從而減慢藥物釋放速度。因此，采用透析法測定的是表觀藥物釋放動力學，是由真實藥物釋放動力學和藥物在半透膜中的滲透動力學兩者共同組成。JANAS等[20]設計了一種基于透析法的分散釋放器(dispersion releaser)(圖4)。該裝置由樣品供給室和外側透析膜組成，供給室內裝有攪拌槳。該裝置可裝載于USP第二法溶出裝置(槳法)上，利用溶出儀攪拌動力，在供給室內對納米藥物進行攪拌，避免藥物在透析裝置內沉降聚結，促進藥物擴散通過半透膜；并以氟比洛芬為模型藥物，計算膜滲透常數，應用數學模型獲得標準化藥物釋放曲線。

圖4 分散釋放裝置圖[20]

2.3流通池法 流通池法是指將釋放介質以適宜的恒定流速流經樣品適配器，與適配器內樣品接觸，釋放介質經適配器上方過濾流出，在不同時間測定釋放介質中藥物濃度，計算釋放度的方法。根據釋放介質是否循環流經適配器，還分為開放式和循環式流通池法。該方法優勢是，溶出裝置為《中華人民共和國藥典》標準溶出裝置，樣品位置以及樣品與釋放介質接觸面積固定，釋放過程中釋放介質不斷流經樣品，可以維持適宜的漏槽條件，避免局部濃度差較低[21]。

YUAN等[22-23]使用流通池法結合透析裝置，建立了多柔比星脂質體體外釋放方法，通過優化介質中羥丙基-環糊精濃度、溫度和待測樣品濃度等參數，可以區分不同組成、不同理化性質和不同制備工藝所制備的多柔比星脂質體。TANG等[24]和LIU等[25]聯合FDA相關研究人員建立了流通池法測定兩性霉素B脂質體體外溶出，可以區分已上市兩性霉素B脂質體原研產品(AmBisome?)及其仿制藥，對產品質量控制以及仿制藥開發具有重要指導意義。

2.4其他方法 MENEZES等[26]開發了一種傳統槳法和超濾離心組合新方法，并與傳統取樣分離法、透析法進行比較，該組合方法更適合研究納米顆粒制劑藥物釋放動力學。納米藥物的體外溶出測定方法還有電化學方法，該法是一種快速原位測量方法，可以實時監測藥物釋放，同時可以避免釋放介質中未溶解藥物引起的干擾[27]。但該技術僅適用于具有電化學活性的藥物，其敏感性和響應性差異很大。除電化學方法外，非電化學法，如量熱法[28]也可用于納米藥物體外溶出研究。CHI等[29]使用自制便攜式分析儀測定3種非甾體抗炎藥電紡絲的藥物溶出。該方法可在線同步監測多種藥物釋放，且線性檢測范圍很寬，檢測限(limit of detection，LOD)低至 μg·mL-1水平，為快速準確檢測納米纖維類制劑的溶出度提供了一種有前景的方法。

3 數學模型的建立及體內外相關性

藥物釋放機制和動力學是描述藥物溶出的兩個重要特征。藥物在溶出介質中的溶解過程涉及不同物理現象，包括顆粒表面的潤濕、固態作用力破壞、溶劑化、液體間擴散及周圍液體對流現象等。利用數學模型可以更好地理解特定劑型的藥物釋放機制，利用計算機模擬技術獲得的藥物釋放動力學可用于優化藥物處方設計并減少藥物制劑開發時間和成本。ROOS等[30]開發了一種新型納米藥物溶出數學模型，以預測藥物在體內吸收機制。PONTRELLI等[31]通過數學模型參數反映pH敏感型載藥納米載體的釋放，可用于表征藥物動力學，從而優化納米藥物處方工藝。臨床研究中，DOGRA等[32]利用數學模型研究納米顆粒、腫瘤和個體相關參數確定納米材料在腫瘤遞送中的作用。JAFARI等[33]研究新型預合成磁性納米復合聚氨酯基質的藥物釋放機制，并開發了一種合適的數學模型來預測體外乳腺癌治療的定量靶向藥物遞送。

目前常用的數學模型包括零階模型、一階模型、Hixson-Crowell 模型立方根方程、Korsmeyer-Peppas 動力學方程和 Higuchi 模型等，通常使用多種數學模型組合提高預測準確性[33]。FAZLI-ABUKHEYLI等[34]在研究納米多孔陽極氧化鋁植入物改善局部藥物遞送的過程中提出了一種新的兩階段釋藥模型：第一階段采用零級動力學模型，第二段采用一級動力學模型。將實驗數據擬合到新模型中，實驗數據與該模型預測數據相關性較好。

除體外溶出測定方法優化外，數學模型還可應用于納米藥物溶出的體內外相關性優化。體內外相關性(invitro-invivocorrelation，IVIVC)是指藥物制劑的生物學性質與其物理化學性質(如體外釋放度)之間建立的定量關系。通常將納米藥物體外溶出數據和血漿藥物濃度時間曲線進行數學處理以建立相關性。IVIVC研究有助于加快藥物處方篩選，為溶出測定方法的建立及生物等效性研究提供參考。然而建立具有良好IVIVC的納米藥物體外溶出測定方法仍具有較大挑戰，藥物的理化性質、制劑結構特點及生理環境均會對其產生影響[35]。SINGH等[36]使用混合計算機模擬模型預測替莫泊芬脂質體在人體中的藥動學，建立了A級IVIVC。SARANGI等[37]在洛伐他汀固體脂質納米粒的IVIVC研究中，通過優化數學模型，獲得了良好的A級相關性，回歸系數值為0.902。對已有數學模型進行分析和系統性優化，可以有效提高IVIVC的準確性。

4 總結與展望

體外溶出評價是控制納米藥物質量的重要手段，也是納米藥物處方工藝研究階段的重要指標。納米藥物體外溶出測定往往存在許多挑戰，如納米藥物粒徑分布不均勻且結構復雜，體外溶出實驗時取樣分離不準確，過濾破壞納米藥物結構等。此外，納米藥物體內釋放易受各種生理因素影響，例如體液量、血流速度、體內酶和蛋白、細胞作用等。因此建立具有良好體內體外相關性的體外溶出測定方法仍存在很大挑戰。但隨著納米藥物體外溶出測定方法研究的深入，包括溶出裝置的改善、溶出介質的復雜性提升、數學模型及計算機輔助的介入，納米藥物的體外溶出測定方法開發日趨成熟。越來越多的方法顯著改善了對納米藥物關鍵質量屬性的區分力，為基于納米藥物的仿制藥研發、創新制劑設計、納米藥物質量監管提供了有效幫助。