納米載藥系統調控腫瘤相關巨噬細胞抗腫瘤研究進展

韋朝晗，丁梓蕎，張曉瓊，雍土瑩，甘璐，楊祥良

(1.華中科技大學生命科學與技術學院，武漢 430074；2.國家納米藥物工程技術研究中心，武漢 430074)

腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)占實體腫瘤浸潤淋巴細胞的約50%，是腫瘤微環境的重要組成部分[1-3]。組織固有巨噬細胞、血液中循環的單核細胞(monocytes)和單核型骨髓來源抑制性細胞(monocytes myeloid derived suppressor cells，M-MDSCs)進入腫瘤組織，并在腫瘤微環境的誘導下分化成TAMs[4]。按照其功能和表型可分為兩大類，即經典活化型巨噬細胞(M1型)和替代活化型巨噬細胞(M2型)[5-6]。M1型TAMs具有強的抗原呈遞，吞噬腫瘤細胞，分泌促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-12(IL-12)，釋放活性氧和一氧化氮等能力，發揮抗腫瘤作用[1-4]。M2型TAMs則通過釋放轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和IL-10等，促進腫瘤生長、轉移、耐藥、免疫逃逸和血管新生，發揮促腫瘤作用[1-4]。目前針對TAMs的治療主要有抑制TAMs招募、清除TAMs、逆極化TAMs及增強TAMs吞噬能力等方式[7-8]。但是，如何將發揮這些作用的效應分子高效靶向遞送至TAMs，減少脫靶帶來的正常細胞和機體損傷，仍然是一個很大的挑戰。納米藥物是將藥物包封于納米尺度的微粒中，通過修飾、優化，可以調節藥物釋放速度、增加特異性靶向、改變藥物在體內的分布、提高藥物生物利用度等[9-12]。因此，利用納米藥物靶向調控TAMs，減輕不良反應，提高腫瘤治療效果，是一個理想的技術手段[13-18]。筆者在本文對納米藥物靶向TAMs的策略進行綜述。

1 抑制TAMs招募

負載CCR2 siRNA的納米粒通過靶向清除Ly6Chigh單核細胞，抑制TAMs招募，降低腫瘤體積[19](*P<0.05)。

2 靶向清除TAMs

靶向血液或骨髓中的單核細胞雖然能夠抑制巨噬細胞的招募，但是也會對機體正常單核細胞的功能產生影響，導致毒副作用，影響腫瘤治療效果[7]。因此，阻斷巨噬細胞活性最徹底的方法是清除腫瘤組織內巨噬細胞。

研究發現，雙膦酸鹽，如唑來膦酸或氯磷酸鹽對巨噬細胞具有特異毒性，但是雙膦酸鹽在體內半衰期較短，較難達到對巨噬細胞產生效應的濃度[23]。因此使用納米藥物載體技術，通過脂質體負載雙膦酸鹽，將其遞送至腫瘤組織誘導M2型TAMs凋亡，可引起新生血管受損，抑制腫瘤轉移，發揮較好的抗腫瘤效果[24]。TIAN等[25]合成了一種聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾的可用于單光子斷層掃描成像(single-photon-emission computed tomography，SPECT)和腫瘤同位素放療(radioisotope therapy，RIT)的雙膦酸鈣納米顆粒(CaBP-PEG)。荷瘤小鼠尾靜脈給藥后，經SPECT觀察發現CaBP(99mTc)-PEG納米粒在腫瘤部位高度富集。由于雙膦酸鹽對M2型TAMs的清除，能夠抑制腫瘤血管新生，使腫瘤血管正常化，增強腫瘤組織滲透性，改善腫瘤乏氧微環境，進一步改善CaBP(32P)-PEG納米粒的放療效果，顯著抑制腫瘤生長(圖2A)。

利用TAMs(類似于M2型)高表達甘露糖受體的特點，在脂質體、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]納米粒等納米載體表面修飾甘露糖，提高對TAMs的特異性靶向。NIU等[26-28]在甘露糖化的PLGA納米粒表面修飾pH敏感的PEG，特異性提高M2型TAMs對納米粒的攝取，高效遞送多柔比星至TAMs，清除TAMs，發揮抗腫瘤作用。其他的蛋白、多肽等也用于TAMs的靶向性修飾。如QIAN等[29]針對TAMs高表達清道夫受體(scavenger receptor B type 1，SR-B1)的特點，構建由SR-B1靶向肽和M2巨噬細胞結合肽(M2-macrophages targeted peptide，M2pep)構成的雙重靶向納米顆粒，負載CSF1R siRNA(M2NP-siCD115)，實現以M2型TAMs的CSF-1R為靶標的免疫治療策略。該雙重靶向納米顆粒對M2型TAMs的親和力顯著高于脾臟、肝臟和肺中的巨噬細胞，可有效降低小鼠黑色素瘤M2型TAMs比例，抑制腫瘤生長，延長小鼠生存期。在特異性清除M2型TAMs的同時，該納米顆粒能有效抑制腫瘤微環境中免疫抑制因子IL-10和TGF-β產生，上調免疫刺激因子IL-12和IFN-γ表達，并增強CD8+T細胞在腫瘤組織的浸潤和激活，重塑腫瘤免疫微環境，為分子靶向腫瘤免疫治療提供一種潛在的臨床應用策略[29](圖2B)。

WANG等[30]設計了一種血紅蛋白-聚(ε-己內酯)[ hemoglobin-poly(epsilon-caprolactone)，Hb-PCL]共軛自組裝仿生納米紅細胞系統(nano-RBC)搭載化療藥物多柔比星[V(Hb)@DOX]。V(Hb)@DOX的Hb部分可以與內源性血漿觸珠蛋白(haptoglobin，Hp)結合，并通過CD163表面受體特異性靶向并殺傷M2型TAMs。此外，Hb釋放的O2能緩解腫瘤乏氧。靶向消除TAMs和緩解乏氧協同改善腫瘤免疫抑制性微環境，同時下調腫瘤細胞程序性細胞死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)表達，降低免疫抑制細胞因子IL-10和TGF-β水平，提高免疫刺激因子IFN-γ含量，增強細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic t lymphocyte，CTL)反應，顯著抑制腫瘤轉移和復發，并產生抗腫瘤免疫記憶反應(圖2C)。

除了靶向遞送小分子藥物、多肽、siRNA外，使用納米藥物介導的光動力學也能達到TAMs清除的目的。BEN-NUN等[31]開發了小分子淬滅活性探針(quenched activity-based probes，qABPs)負載光敏劑(YBN14)，在光刺激下使TAMs受到氧化應激而損傷，在乳腺癌小鼠模型中發揮良好的抗腫瘤活性。另外，有研究者將近紅外酞菁染料IRDye700偶聯至抗CD206抗體上(IRD-aCD206)，在對索拉非尼耐藥的4T1乳腺癌模型中顯示出良好的抗腫瘤活性和抑制肺轉移能力[32](圖2D)。

A.CaBP-PEG 納米粒靶向腫瘤組織，用于腫瘤 SPECT成像，且能清除TAMs，改善腫瘤微環境，增強放療效果[25]；B.M2NP-siCD115 靶向清除M2型TAMs，激活CD8+ T細胞，抑制腫瘤生長[29]；C.V(Hb)@DOX殺傷M2型TAMs[30]；D.YBN14通過光動力學清除TAMs[31](*P<0.05；***P<0.001)。

3 逆極化TAMs

TAMs主要表現為促腫瘤的M2型，將其逆極化成M1型將有助于恢復巨噬細胞防御功能，有效殺傷腫瘤細胞。在TAMs中引入促M1型極化的細胞因子、小分子藥物等，或者阻斷TAMs中M2型極化的通路，都是將M2型TAMs逆極化成M1型TAMs的有效途徑。IFN-γ是導致M1型巨噬細胞極化的典型刺激物之一。將IFN-γ腹腔注射至患有卵巢癌的女性體內，能夠避免系統性巨噬細胞激活，增強臨床免疫反應[33]。其他臨床批準的方法如對晚期胰腺癌患者使用激動劑抗體CD40，或對多型膠質母細胞瘤患者使用BLZ945(一種高選擇性CSF-1R小分子抑制劑)，都能夠引發TAMs逆極化，顯著延長患者生存期[34-35]。除此之外，microRNA、siRNA，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)激動劑，胞內磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinase，PI3K)、布魯頓酪氨酸蛋白激酶(Bruton tyrosine kinase，BTK)、信號轉導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)和信號轉導及轉錄激活蛋白6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)通路抑制劑，富含組氨酸的糖蛋白(histidine-rich glycoprotein，HRG)，納米氧化鐵等都能夠誘導TAMs逆極化[36-37]。

為達到更好的逆極化效果，使用納米藥物靶向逆極化M2型TAMs已經成為目前的研究熱點之一。考慮到TAMs上甘露糖受體高表達，ORTEGA等[38]設計了一種甘露糖修飾的負載IκBα siRNA的聚合物納米粒，有效靶向M2型TAMs并激活NF-κB通路，實現TAMs逆極化，表現出良好的抗腫瘤效果。類似的研究，HUANG等[39]設計了由pH敏感的PEG-組胺修飾的海藻酸鹽、陽離子白芨多糖及TLR7配體miRNA let-7b構成的聚合物納米粒(let-7b&vector)，尾靜脈注射至荷瘤小鼠體內能夠實現長循環，避免被其他組織中的巨噬細胞吞噬。而在到達弱酸性腫瘤微環境后，pH敏感的PEG-組胺解聚，暴露出修飾的白芨多糖，與M2型TAMs上的甘露糖受體結合，能特異性靶向并逆極化M2型TAMs至具有抗腫瘤活性的M1型，減緩小鼠4T1腫瘤生長(圖3A)。另外，HUANG等[40]還設計半乳糖化的陽離子葡聚糖納米復合物，靶向M2型TAMs半乳糖型凝集素受體，將CpG、抗IL-10和抗IL-10R寡聚核苷酸傳遞至M2型TAMs，同樣也達到逆轉M2型TAMs極性、誘導TAMs抗腫瘤活性的目的。另外，GAO等[41]合成負載miR155的納米凝膠，在其表面包裹紅細胞膜并修飾M2pep，合成類似于病毒的核酸納米凝膠，能夠靶向并重編程小鼠腦膠質瘤M2型TAMs，重塑腫瘤免疫微環境，有效抑制腫瘤生長。

細胞微顆粒(cellular microparticle，MPs)是細胞對各種內源性或外源性刺激的反應所釋放的囊泡，直徑為100～1000 nm。由于其具有細胞間信息交流能力，以及優越的循環穩定性、高生物相容性、低免疫原性和毒性而具有作為藥物傳遞系統的潛力[42-44]。筆者所在課題組利用甘露糖修飾的巨噬細胞來源微顆粒(Man-MPs)負載二甲雙胍(Met@Man-MPs)，有效地靶向M2型TAMs并將其逆極化為M1型。逆極化后的TAMs通過增加腫瘤組織中CD8+T細胞的招募，減少MDSC和Treg的免疫抑制浸潤，重塑腫瘤免疫微環境。更重要的是，Man-MPs的膠原降解能力有助于CD8+T細胞浸潤到腫瘤內部，且可增強PD-1抗體的腫瘤富集和滲透。Met@Man-MPs的這些特點顯著增強PD-1抗體治療效果，且形成長期免疫記憶抑制腫瘤復發[45](圖3B)。

TLRs能夠誘導抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells，APC)介導的免疫反應，但使用TLRs激活劑直接治療腫瘤會導致自身免疫疾病[46]。RODELL等[47]將TLR7/8激動劑R848和β-環糊精共價交聯形成具有巨噬細胞高親和力和高載藥量的環糊精納米顆粒(CDNP-R848)。體內實驗表明，CDNP-R848在不同腫瘤模型中均能夠實現有效的M2型TAMs靶向遞送，改變TAMs表型，增強PD-1抗體的抗腫瘤效果，且能形成特異性腫瘤免疫記憶(圖3C)。KIM等[48]將TLR7/8激動劑R848包裹在納米乳劑中，該載藥納米乳劑在凍干、復溶后依舊能夠維持良好的生化特性和藥物活性。通過和腫瘤抗原聯合原位給藥，該納米載體能夠引起固有免疫細胞的招募和激活，T細胞浸潤，TAMs的逆極化，抑制原位腫瘤和再接種腫瘤的生長，顯著延長小鼠生存期，而且同樣有助于增強抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體的免疫反應。

另一個有意思的例子是納米氧化鐵。納米氧化鐵是一種超順磁性氧化鐵(ultrafine superparamagnetic iron oxide，USPIO)納米顆粒。ZANGANEH等[49]使用經美國食品藥品管理局(FDA)批準用于治療缺鐵性貧血的ferumoxytol氧化鐵納米粒注射到小鼠體內，有效抑制早期乳腺癌的生長和肝轉移，還可用作肝臟、脾臟、淋巴等器官的磁共振成像增強劑[50](圖3D)。進一步的實驗結果揭示了其作用機制：ferumoxytol作用于M2型TAMs，上調Th1免疫反應相關的mRNA，使其向M1型逆極化。而逆極化后的M1型巨噬細胞能夠產生各種炎癥因子和活性氧，激活腫瘤細胞caspase-3活性，最終導致腫瘤細胞凋亡，發揮抑制腫瘤生長和預防肝轉移的良好效果[50]。除ferumoxytol外，其他納米鐵劑也能發揮逆極化TAMs，殺傷腫瘤細胞的作用[51-53]。如LI等[54]使用負載透明質酸修飾的超順磁性氧化鐵(hyaluronic acid-decorated superparamagnetic iron oxide nanoparticles，HIONs)的巨噬細胞作為載藥系統。發現其表現出更強的腫瘤靶向性、更高效的活性氧和抗腫瘤細胞因子的釋放能力，對腫瘤細胞展現出更強的殺傷能力，并通過類似于旁分泌途徑誘導腫瘤中M2型TAMs逆極化，改善腫瘤免疫抑制性微環境，發揮良好的腫瘤抑制效果(圖3E)。

let-7b&vector(A)[39]、Met@Man-MPs(B)[45]、CDNP-R848(C)[47]、ferumoxytol 氧化鐵納米粒(D)[49]、負載HIONs的巨噬細胞(E)[54]和Dic@M2pep-Fe-MOF(F)[57]誘導 M2 型 TAMs 逆極化至 M1 型，改善腫瘤免疫抑制性微環境，抑制腫瘤生長。

除此之外，針對M2型TAMs鐵外排能力強導致鐵納米載藥系統逆極化M2型TAMs受限而影響抑瘤效果的問題[55-56]，筆者所在課題組設計M2靶向肽修飾的鐵基金屬有機框架材料負載鐵外排抑制劑雙氯芬酸鈉(Dic@M2pep-Fe-MOF)用于腫瘤的免疫治療[57]。Dic@M2pep-Fe-MOF可有效靶向M2型TAMs，上調鐵調素hepcidin，抑制轉鐵蛋白ferroportin表達，增加胞內鐵滯留，抑制鐵外排，促進M2型TAMs逆極化成M1型，激活CD8+T細胞抗腫瘤免疫反應，顯著抑制腫瘤生長，延長小鼠生存期；且形成長期抗腫瘤免疫記憶，抑制腫瘤復發(圖3F)。

4 增強TAMs吞噬能力

巨噬細胞可吞噬腫瘤細胞，一方面直接清除腫瘤細胞，另一方面將捕獲的腫瘤細胞抗原進行加工，呈遞給T細胞，啟動抗腫瘤免疫反應[58]。然而腫瘤細胞過表達CD47，與巨噬細胞上的信號調節蛋白α(signal regulatory protein α，SIRPα)結合，傳遞“別吃我”的信號，避免被巨噬細胞吞噬，實現免疫逃逸[59]。因此靶向阻斷CD47-SIRPα信號有利于恢復巨噬細胞對腫瘤細胞的識別和吞噬，誘發抗腫瘤免疫反應。NIE等[60]將pH敏感鍵修飾至CD47抗體和SIRPα抗體上，再通過點擊化學反應將抗體與M1型巨噬細胞來源外泌體結合(M1 Exo-Ab)，其在腫瘤弱酸性條件下，釋放CD47抗體和SIRPα抗體阻斷CD47-SIRPα信號通路，同時M1 Exo促進TAMs逆極化成M1型，增強對腫瘤細胞的吞噬和清除(圖4A)。類似地，CHEN等[61]構建ROS敏感的負載PD-1抗體和CD47抗體白蛋白納米粒(aPD1@aCD47 complex)，在腫瘤組織ROS刺激下，釋放PD-1抗體以激活T細胞，釋放CD47抗體促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬和抗原提呈，啟動T細胞介導的抗腫瘤免疫反應，有效抑制小鼠B16-F10腫瘤的生長(圖4B)。ZHANG等[62]合成同時負載CD47抗體和促細胞吞噬的鈣網蛋白(calreticulin，CALR)的納米材料(SNPACALR&aCD47)，在抑制CD47-SIRPα“別吃我”信號通路的同時，增強巨噬細胞低密度脂蛋白受體相關蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP-1)和CALR結合后傳遞的“吃我”信號，提高巨噬細胞對腫瘤的吞噬能力(圖4C)。

M1 Exo-Ab(A)[60]、aPD1@aCD47 complex(B)[61]、SNPACALR&aCD47(C)[62]阻斷腫瘤細胞與巨噬細胞的 CD47-SIRPα 信號通路，增強巨噬細胞對腫瘤的吞噬，提高抗腫瘤效果。

M1 Exo-Ab (A)[60]，aPD1@aCD47 complex (B)[61]and SNPACALR&aCD47 (C)[62]disrupt CD47-SIRPα signaling pathway between tumor cells and TAMs，improve macrophage-mediated phagocytosis of tumor and antitumor effects.

Fig.4 Nanomedicines enhance macrophage phagocytosis of TAMs by targeted blocking of CD47-SIRPα signaling pathway

5 TAMs作為納米藥物的載體和藥物“倉庫”

作為體內重要的固有免疫細胞，巨噬細胞能夠識別炎性病變部位，是理想的靶向傳遞抗腫瘤藥物的天然載體[63]。AN等[64]使用硫醇化PEG(HS-PEG)修飾金納米粒(Au nanoparticles，AuNPs)，再將AuNPs負載至RAW264.7小鼠巨噬細胞中(anionic-AuNRs@RAW)。該巨噬細胞介導的納米載藥系統可穿透腫瘤組織，進入核心乏氧區域，提供高質量的腫瘤光聲成像，增強腫瘤光熱治療(圖5A)。CAO等[65]在巨噬細胞表面修飾豆莢蛋白敏感的蜂毒肽legM和細胞毒性藥物DM4，制備基于巨噬細胞的給藥系統(legM-DM4-macrophage based delivery system，LD-MDS)。LD-MDS利用轉移的腫瘤細胞高表達豆莢蛋白和巨噬細胞對轉移腫瘤的靶向性，高效靶向至肺部腫瘤轉移病灶，在豆莢蛋白作用下巨噬細胞形成負載DM4的類似于外泌體的納米微囊泡(DM4-loaded exosome-like nanovesicles，DENs)，有效將藥物遞送至微小轉移灶，實現在腫瘤肺轉移病灶智能定點釋藥，抑制乳腺癌肺轉移(圖5B)。

另外，由于巨噬細胞極強的吞噬能力，納米材料在TAMs的富集遠高于腫瘤細胞。MILLER等[66]制備了裝載熒光分子和四價Pt前藥的PLGA-PEG高分子納米粒。研究結果發現，該納米粒被TAMs大量攝取，導致納米藥物在腫瘤組織高度富集。同時，TAMs吞噬納米載體后，能夠再將其傳遞至周圍的腫瘤細胞，提高納米藥物在腫瘤部位的蓄積和深部穿透(圖5C)。ZHAO等[67]的研究結果表明，經化療藥物治療后，腫瘤部位TAMs浸潤增加。TAMs的增加引起石墨烯納米粒在腫瘤部位的蓄積量增加，增強了基于石墨烯納米粒的光動力學治療效果，有效抑制腫瘤生長。

A.Anionic-AuNRs@RAW 有效靶向至腫瘤組織乏氧區域，用于腫瘤光聲成像和光熱治療[64]；B.LD-MDS 可有效靶向至腫瘤肺部轉移病灶，并形成DENs，抑制腫瘤肺轉移[65]；C.TAMs作為載有 Pt 前藥 PLGA-PEG 高分子納米粒的“倉庫”，向臨近腫瘤細胞持續釋放藥物[66]。

6 問題與展望

采用納米藥物靶向TAMs的腫瘤免疫治療策略，吸引了科研人員的廣泛關注，得到迅猛而深入的研究和發展，是近年來的研究熱點之一[13，68]。盡管靶向TAMs取得了一定的研究進展，但是仍然存在許多問題和挑戰。靶向TAMs主要利用的是巨噬細胞強吞噬能力介導的被動靶向和配體-受體相互作用介導的主動靶向。被動靶向會引起其他組織中的巨噬細胞非特異性吞噬納米藥物，導致毒副作用[69]。而主動靶向主要依賴于TAMs高表達的一些特異性受體。但事實上，這些所謂的“特異性”受體并非只在巨噬細胞表達，例如DCs上也表達甘露糖受體[39]，腫瘤細胞上也有葉酸受體表達[16]。而且，TAMs并不是單純的M1或者M2型，會表現出復雜的功能和基因表達[70]。因此，實現TAMs的特異性靶向和調控，仍然是一個艱巨的挑戰。

納米藥物通過抑制巨噬細胞招募、殺傷TAMs、逆極化TAMs等途徑發揮抗腫瘤效果，但是其作用速度相對遲緩，作用效果相對有限[4]。因此，將TAMs納米靶向治療和其他的治療手段如免疫抑制劑、熱療、放療和化療等相結合，協同作用下將會取得更加顯著的效果，將會具有更加廣闊的應用前景。