GJ-4對帕金森病模型小鼠的保護作用及其機制*

袁方玉，盛嬋娟，鞠程，李方園，臧彩霞，尚俊美，劉慧，鮑秀琦，張丹

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是發病率僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的神經退行性疾病。其主要病理特征為中腦多巴胺能神經元進行性變性死亡及細胞內路易小體形成，最終導致黑質-紋狀體多巴胺能神經系統功能衰退，從而產生運動障礙。其主要臨床表現為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩。流行病學調查顯示，世界范圍內65歲以上人群該病發病率約1%，80歲以上人群發病率3%，該病嚴重影響老年人身體健康和生活質量[1]。

近年來研究發現，神經炎癥和細胞凋亡可能在PD發生和發病進程中起作用，炎癥調節因子可能促進α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)錯誤折疊和聚集，并造成α-Syn擴散[2]。PD患者及PD動物模型中誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[3-4]、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)[5]等炎癥因子表達增加，表明炎癥在PD發病中起關鍵作用，因此針對炎癥可能具有治療或延緩PD發病的作用[6]。此外，PD發病過程中還涉及多種細胞死亡途徑[7]，其中細胞凋亡尤為重要。研究表明，B淋巴細胞瘤-2(B lymphoblastoma-2，Bcl-2)可保護腦組織免受有毒物質損傷，過表達Bcl-2的多巴胺能神經元纖維更長，表明Bcl-2具有促進多巴胺能神經元發育作用，但Bcl-2異常表達可能導致PD發生和發展[8]。

GJ-4是從中藥梔子中提取的富含藏紅花色素類活性成分的物質[9-10]，此前有學者采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器(high-performance liquid chromatography-diode array detection，HPLC-DAD)于波長440 nm對GJ-4進行成分分析，發現GJ-4中主要成分為藏紅花酸二葡糖基酯(dicrocin)和藏紅花素(crocin)[11-12]。前期研究表明，GJ-4可顯著抑制AD小鼠腦內炎癥反應，提高小鼠學習記憶能力[13]，GJ-4是否對PD有神經保護作用值得進一步研究。筆者在本實驗采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-metyl-4-fenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridin，MPTP)致小鼠亞急性PD模型觀察GJ-4對PD的治療作用，并初步探索其作用機制[8]。

1 材料與方法

1.1試劑 MPTP[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，批號：SLBZ7928]，GJ-4(暨南大學姚新生院士課題組提供)，左旋多巴(levodopa，L-Dopa，上海羅氏制藥有限公司，批號：SH2912)，放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、BCA(bicinchoninic acid assay)蛋白定量試劑盒(上海生工生物科技有限公司，批號分別為G707DA0012、G911DB0003)，蛋白磷酸酶抑制劑(北京索萊寶科技有限公司，批號：20200819)，蛋白酶抑制劑(陶素生化科技有限公司，批號：C001)，10%免封閉聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)凝膠快速制備試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，批號：P8010690)，兔抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)多克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號分別為0030420101，9100026001，9300014001)，兔抗iNOS多克隆抗體(cell signaling technology，CST，批號：5)，Transzol up plus RNA kit提取試劑盒、Reverse Transcriptase試劑盒、Super Mix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司，批號分別為N30289、O10306、N30821)，羧甲基纖維素鈉[sodium carboxymethyl cellulose salt，CMC-Na，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，批號：SLBW8428]，0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，批號：2106152003)，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS，北京索萊寶科技有限公司，批號：G0002)，水合氯醛、蔗糖、多聚甲醛[福晨(天津)化學試劑有限公司，批號分別為20190509，20190122，20190910]，5×上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，批號：20190718)，脫脂奶粉(蘭杰柯科技有限公司，批號：70120200)，聚偏乙烯氟化物膜[polyvinylidene fluoride，PVDF，密理博(Millipore)公司，批號：R0HB74436]。

1.2儀器 小鼠轉棍儀(意大利Ugo Basile公司)，爬桿棒(中國醫學科學院藥物研究所)，DYY-6C型垂直電泳儀和電轉儀系統(北京六一儀器廠)，Eclipse 80i正置顯微鏡(日本Nikon公司)，LAS4000生物分子成像儀(美國GE公司)，7900HT96快速實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(美國ABI公司)，SIGMA 3-18K型冷凍高速離心機[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司]。

1.3實驗動物 C57/BL6J小鼠，雄性，體質量22～25 g，購自北京華阜康生物科技有限公司。實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2014-0004，實驗動物合格證號：SCXK(京)2014-0023。小鼠自由進食進水，于室溫24～25 ℃、相對濕度50%～60%、明暗各12 h交替的藥物非臨床研究質量管理規范(good laboratory practice，GLP)動物房飼養。實驗中所有操作均遵循北京市實驗動物倫理委員會規定。

1.4小鼠分組及模型制備與給藥 將小鼠適應性飼養3 d，采用轉棍法剔除運動不協調小鼠，將剩余小鼠采用隨機區組設計根據體質量隨機分配至空白對照組、模型對照組、GJ-4 25 mg·kg-1組、GJ-4 50 mg·kg-1組、GJ-4 100 mg·kg-1組[14]、陽性對照組(L-Dopa組，20 mg·kg-1)，每組15只。以0.5%CMC-Na將GJ-4配制為濃度分別為2.5，5，10 mg· mL-1的溶液；以0.5% CMC-Na配制2 mg· mL-1L-Dopa溶液。GJ-4各劑量組與陽性對照組小鼠分別灌胃給予相應劑量GJ-4與L-Dopa，空白對照組與模型對照組灌胃給予相同劑量0.5% CMC-Na。給藥后30 min，模型對照組、陽性對照組和GJ-4各劑量組腹腔注射3 mg·mL-1MPTP，每天1次，連續7 d。停止注射MPTP后繼續給藥，每天1次，連續5 d。實驗第7天和第12天進行轉棍實驗和爬桿測試，第13天將小鼠斷頭取腦，檢測相關指標。

1.5小鼠運動協調能力測試

1.5.1爬桿實驗 將一直徑25 cm軟木球固定于一根長50 cm、粗1 cm木桿頂端，木桿纏上紗布以防打滑，將被測小鼠放至小球上，觀察小鼠從球上下來的表現，給出不同評分。評分標準如下，5分：四肢并用，一步一步協調向下爬行；4分：一步一步向下爬行但兼有后肢滑行行為；3分：爬過一半距離后向下滑行，但可抱緊桿；2分：未爬過一半距離即出現滑行行為；1分：爬過一半距離后無法抓桿從桿上掉落；0分：未爬過一半距離即無法抓桿，從桿上掉落。每只小鼠測試2次，按照上述標準評分，取平均值。

1.5.2轉棍實驗 各組小鼠在造模前接受3次轉棍訓練。經過訓練后，小鼠在棍上的表現達到穩定水平。轉棍為直徑4 cm、長60 cm、用隔板平均分為5段的水平桿，保證動物彼此不受影響。轉速設置為30 r·min-1。將小鼠置于桿上，打開開關，開始計時，最長時限設置為120 s，記錄從開始到小鼠掉落時間，記為潛伏期(即第一次從桿上掉落的時間)，根據小鼠在轉棍上停留時間評價GJ-4對PD模型運動協調能力影響的改善作用。

1.6免疫組化實驗 末次行為學測試后，每組隨機(對動物編號，通過抽選隨機數的方法抽取)選取小鼠3只，以4%水合氯醛麻醉，0.9%氯化鈉注射液進行心臟灌流，持續10～15 min至肝臟完全變白，換用3%蔗糖4%多聚甲醛PBS溶液繼續灌注15～20 min，待小鼠肝臟變硬、肢體僵硬即完成固定。灌流小鼠斷頭取腦，腦組織脫水固定。將小鼠腦組織固定在冷凍切片機進行恒冷切片，片厚40 μm，收集中腦部位腦片進行TH免疫組化染色。每組小鼠3只，每只小鼠選取相同部位腦片8張，共得腦片24張，正置顯微鏡觀察黑質區域，計數小鼠黑質部位陽性神經元數目，由與本實驗無關人員計數。

1.7Western blotting實驗 取小鼠中腦，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑充分勻漿，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min(r=82.0 mm)，吸取上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白樣品的濃度測定，用上樣緩沖液將蛋白濃度調整一致，混勻煮沸使蛋白變性。用10%PAGE(10%免封閉PAGE凝膠快速制備試劑盒)凝膠電泳分離蛋白，蛋白上樣量40 μg。電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫搖動封閉2 h，4 ℃分別與兔抗TH多克隆抗體(1：500)、兔抗iNOS多克隆抗體(1：500)和兔抗β-actin單克隆抗體(1：1000)共孵育過夜。洗膜3次，再與相應辣根過氧化物酶標記的二抗(ABclonal)共孵育2 h。使用LAS 4000(美國GE公司)進行ECL化學顯色。Gel Pro分析條帶灰度，目的蛋白和內參蛋白的灰度值比值代表目的蛋白相對表達量。

1.8實時熒光定量PCR(realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)實驗 按照Transzol up plus RNA kit提取試劑盒、Reverse Transcriptase試劑盒操作說明提取小鼠中腦RNA和逆轉錄合成cDNA。采用Super Mix試劑盒在Applied Biosystems PRISM 7900 PCR儀上將上述樣品分別用TNF-α、IL-1β、Bax和Bcl-2引物擴增，各基因引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1，擴增步驟如下：95 ℃3 min，1 ℃3 min進行預變性；95 ℃變性30 s。60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共進行40 個循環。所有樣品均設3個復孔，使用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量，計算每個目標基因/管家基因β-actin相對量。

表1 qPCR引物序列

2 結果

2.1GJ-4對亞急性PD模型小鼠運動能力的改善作用 與空白對照組比較，模型對照組小鼠爬桿評分明顯降低(P<0.01)，提示模型小鼠出現運動障礙；與模型對照組比較，GJ-4 50 mg·kg-1組和GJ-4 100 mg·kg-1組小鼠爬桿評分顯著提高(P<0.05)，陽性對照組小鼠爬桿評分顯著提高(P<0.05)(圖1A)。

與空白對照組比較，模型對照組小鼠在轉棍上停留時間顯著縮短(P<0.01)，提示其出現行為學障礙；與模型對照組比較，GJ-4 50 mg·kg-1組與GJ-4 100 mg·kg-1組小鼠在轉棍上停留時間顯著延長，且呈劑量依賴性(P<0.05)。與模型對照組比較，陽性對照組小鼠在轉棍上停留時間顯著延長(P<0.05)(圖1B)。結果表明，GJ-4對PD模型小鼠運動障礙具有改善作用。

A.爬桿實驗(n=10～14)；B.轉棍實驗(n=10～14)；①與空白對照組比較，t=3.119～3.480，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.130～3.002，P<0.05。

2.2GJ-4對亞急性PD模型小鼠黑質TH陽性神經元數量與中腦TH蛋白表達的影響 結果見圖2?？瞻讓φ战M小鼠黑質TH陽性神經元染色深；模型對照組染色較淺，分布稀疏，TH陽性神經元數目較空白對照組明顯減少(P<0.01)；而與模型對照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組黑質TH陽性神經元染色較深，TH陽性神經元數量顯著增加(P<0.01)。

Western blot檢測小鼠中腦TH蛋白表達，結果見圖2B。與空白對照組比較，模型對照組TH蛋白表達量顯著降低(P<0.01)；與模型對照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組TH蛋白表達呈現顯著升高(P<0.01)。

A.免疫組化檢測小鼠黑質TH陽性神經元(n=3，×200)；B.Western blot檢測小鼠中腦TH蛋白表達(n=5)；①與空白對照組比較，t=3.671～5.020，P<0.01；②與模型對照組比較，t=4.609～5.189，P<0.01。

2.3GJ-4抑制亞急性PD模型小鼠中腦炎癥因子表達情況 結果見圖3。與空白對照組比較，模型對照組iNOS蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與模型對照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組iNOS表達顯著下降(P<0.05)。

與空白對照組比較，模型對照組TNF-α與IL-β mRNA表達量均顯著上升(P<0.05)；與模型對照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組上述兩種炎癥因子mRNA表達量明顯降低(P<0.05)。

A.Western blot檢測小鼠中腦 iNOS表達(n=5)；B.qPCR檢測小鼠中腦TNF-α mRNA表達(n=4)；C.qPCR檢測小鼠中腦IL-1β mRNA表達(n=4)；①與空白對照組比較，t=2.309～2.956，P<0.05；②與模型對照組比較，t=2.427～2.877，P<0.05。

2.4小鼠中腦神經元凋亡情況 結果見圖4。與空白對照組比較，模型對照組中腦Bax mRNA表達明顯升高(P<0.05)；與模型對照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組中腦Bax mRNA表達顯著降低(P<0.05)。

A.Bax mRNA表達結果(n=3)；B.Bcl-2 mRNA表達結果(n=5)；①與空白對照組比較，t=3.513～6.647，P<0.05；②與模型對照組比較，t=2.594～2.658，P<0.05。

與空白對照組比較，模型對照組中腦Bcl-2 mRNA表達量顯著降低(P<0.05)；與模型對照組比較，GJ-4 100 mg·kg-1組中腦Bcl-2 mRNA表達量明顯升高(P<0.05)。提示GJ-4有抑制模型小鼠多巴胺能神經元凋亡作用。

3 討論

PD是一種常見神經退行性疾病，目前臨床治療藥物主要有復方左旋多巴、單胺氧化酶-B抑制劑、多巴胺受體激動劑等，這些藥物雖然可在一定程度上改善癥狀，但不能根治PD，且長期用藥存在明顯不良反應[15]。

神經保護藥物可在PD前驅期發揮一定作用[16]。GJ-4是中藥梔子提取物，主要活性成分為藏紅花色素，具有抗炎、抑制細胞凋亡等作用[13]。本實驗選用目前最常用的神經毒素MPTP損傷建立小鼠PD模型，MPTP可導致多巴胺能神經元損傷，影響運動功能，因此利用爬桿和轉棍實驗測試小鼠運動能力，同時通過免疫組化及Western blot檢測小鼠中腦TH表達情況，共同反映腦內多巴胺能神經元丟失情況及多巴胺能神經元功能變化。本實驗結果表明，MPTP可導致小鼠出現明顯運動障礙，大劑量GJ-4可顯著改善模型小鼠運動障礙，并能劑量依賴性提高小鼠黑質TH陽性神經元數量。

炎癥和細胞凋亡被認為在PD發生發展過程中起關鍵作用。iNOS[4]、IL-1β、TNF-α等炎癥因子可以通過持續性炎癥反應促進多巴胺能神經元損傷，加劇PD發病進程[17]。有研究發現，在MPTP誘導的小鼠PD模型中，TNF-α分泌增加，并影響DA神經元存活[18]。

KOUCHAKI等[18]研究發現，PD患者血清TNF-α水平升高，推測其為重要的PD預后生物標志物。而在6-OHDA誘導的PD大鼠模型[19]和魚藤酮誘導的PD大鼠模型[20]，抑制IL-1β等炎癥細胞因子表達可減輕紋狀體神經炎癥以及黑質神經元缺失。筆者在本研究中檢測上述炎癥因子，發現GJ-4 100 mg·kg-1能抑制小鼠中腦iNOS蛋白水平表達，并在轉錄水平抑制TNF-α、IL-1β表達，表明GJ-4具有抗炎作用。炎癥和凋亡密切相關，PD主要表現是多巴胺能神經元凋亡。Bcl-2是細胞凋亡蛋白家族中重要的調控蛋白，包括抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax。本實驗結果表明，GJ-4 100 mg·kg-1可在轉錄水平抑制中腦Bax表達，促進Bcl-2表達，從而減少中腦細胞凋亡，起到緩解PD發病進程作用。

綜上所述，GJ-4可明顯改善PD模型小鼠運動協調能力和多巴胺能神經元功能。初步機制研究表明，GJ-4對PD的治療作用可能通過抑制神經炎癥和多巴胺能神經元凋亡實現。以上研究提示，GJ-4有較好的神經保護活性，具有開發成為治療PD新藥的良好前景。