健脾益氣方對腹膜透析大鼠腹膜間皮細胞自噬及上皮間質轉化的影響※

劉前程,劉 鑫,楊端云,史 偉,,鄧湘雨,孟立鋒,

(1.廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530023;2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)具有良好的早期生存率和保護殘余腎功能的作用,是維持終末期腎臟病患者生存的重要治療方法之一,應用前景較好[1]。腹膜纖維化(PF)是導致PD患者超濾衰竭、退出PD治療的首要原因[2-3]。研究發現,腹膜間皮細胞(PMC)受損是導致PF的主要原因之一,PMC上皮間質轉化(EMT)在PF中發揮著重要作用[4-5]。因此,開發相關技術或藥物干預EMT進程,保護PMC正常形態與功能,維持PD有效超濾,對延長PD時間、改善PD患者預后具有重要意義。

自噬即“自我吞噬”,是維持真核細胞內環境穩態,實現生命更新的一種重要進化和保守機制,可使細胞在遭遇各種具有應激性的死亡威脅時,仍然能夠保持存活,但過度的自噬也可導致細胞受損。相關研究表明,PD參與EMT的發生,可誘導PMC自噬[6]。本課題組在前期研究中發現,健脾益氣方能夠有效干預PMC的EMT進程,有效防治PD微炎癥狀態誘導的PMC損傷[7]。本研究通過建立PD大鼠模型,檢測自噬及EMT標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin-1表達水平,觀察健脾益氣方對PD大鼠腹膜形態、PMC自噬及EMT的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選取無特定病原體動物(SPF)級雄性SD大鼠[湖南斯萊克景達動物實驗有限公司提供,實驗動物使用許可證號:SYXK(桂)2019-0001]70只,體質量150～180 g,動物使用符合廣西中醫藥大學倫理委員會管理條例(動物實驗倫理審批號:DW20210426-080),飼養于廣西中醫藥大學動物實驗中心,自由飲水。

1.2 實驗試劑 4.25%乳酸鹽腹膜透析液(廣州百特醫療用品有限公司,國藥準字H20133257,1.5 L/袋);E-cadherin、α-SMA、LC3-Ⅱ、Beclin-1測定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供)。

1.3 實驗藥物 健脾益氣方顆粒(藥物組成:黃芪30 g,黨參15 g,白術10 g,茯苓15 g,丹參15 g,大腹皮6 g,川芎7 g,葛根15 g,炙甘草8 g)由江陰天江藥業有限公司生產,廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司,國藥準字H20051408,20 mg/片)研磨成粉,以蒸餾水配成1 mg/m L的溶液。

2 實驗方法

2.1 分組方法 將70只大鼠適應性喂養后,按隨機數字表法分為假手術組、西藥組、模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組,每組14只。

2.2 模型制備 假手術組不切除腎臟,只剝離腎臟包膜,其余各組行5/6腎切除,檢測腎功能達標后,采取腹腔注射4.25%腹膜透析液透析建立PD大鼠模型,100 m L/kg,每日1次,連續造模4周。

2.3 給藥方式 依據人與動物體表面積折算,健脾益氣方低、高劑量組給藥量分別為9 g/(kg·d)、36 g/(kg·d);西藥組給藥量為1.8 mg/(kg·d)。假手術組、模型組采用0.9%氯化鈉注射液灌胃,每次2 m L,每日1次。連續干預4周。

2.4 實驗取材及標本采集 第28日灌胃后斷頭處死大鼠,取壁腹膜組織。修剪成約5 mm×5 mm大小。一半浸入PLP固定液中,4℃冰箱固定8 h,常規石蠟包埋,另一半置-70℃冰箱保存待測。

2.5 檢測指標 ①一般情況。包括大鼠精神狀況、飲食、活動及體質量等。②腹膜組織蘇木精-伊紅(HE)染色及電鏡觀察PMC超微結構。取大鼠腹膜組織,常規固定、脫水、石蠟包埋、切片后,行 HE、鈾-鉛雙染色,光鏡下觀察大鼠腹膜形態學變化,測量壁腹膜厚度,電鏡下觀察PMC自噬體形成情況。③免疫組織化學法檢測腹膜 LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白表達。石蠟切片脫蠟后進行抗原修復,分別滴加LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin(1∶200),37℃孵育1 h,采用 DAB顯色。蘇木素染核后脫水透明、封片,應用Leica Qwin550圖像分析軟件進行半定量分析,400倍視野下測定陽性面積比。④蛋白質印跡法(Western blotting)檢測腹膜LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白表達。采用400μL裂解液提取腹膜組織總蛋白,采用BCA法測量蛋白濃度后,進行SDS-PAGE垂直電泳,轉膜。用脫脂奶粉封閉后,分別加入抗體LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin,孵育過夜。TBST洗滌后,室溫下孵育二抗30 min,采用ECL發光液顯色。

2.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件處理數據。計量資料符合正態分布時以均數±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況比較 實驗期間,先后有16只實驗大鼠死亡,死亡原因包括術后感染、灌胃不當等。最終大鼠數量為:假手術組12只,模型組10只,西藥組12只,中藥低劑量組11只,中藥高劑量組9只。實驗期間,各組大鼠表現明顯不同,造模前,各組大鼠飲食、運動可,動作迅速;造模后,除假手術組外,其余各組均出現喜好蜷臥、反應遲鈍等癥狀,且體質量逐漸下降。

3.2 光鏡下各組大鼠腹膜病理表現比較 假手術組大鼠腹膜組織連續和完整,PMC覆蓋完好,厚度均勻。模型組腹膜變厚明顯,部分呈柱形,PMC可見明顯脫落及膠原纖維沉積等病理變化。中藥干預后,腹膜組織厚度、膠原纖維沉積及炎癥細胞浸潤情況較模型組明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠光鏡下腹膜組織病理圖(×400倍)

3.3 腹膜致密層厚度及 LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白陽性面積比比較 與假手術組相比較,模型組腹膜致密層厚度及Beclin-1、α-SMA、LC3-Ⅱ蛋白陽性面積比均升高(P＜0.05),E-cadherin蛋白陽性面積比均降低(P＜0.05)。與模型組相比,西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組腹膜致密層厚度及LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白陽性面積比均降低(P＜0.05),E-cadherin蛋白陽性面積比均升高(P＜0.05)。與模型組、西藥組、中藥低劑量組比較,中藥高劑量組腹膜致密層厚度及LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA 蛋白陽性面積比均降低(P＜0.05),E-cadherin蛋白陽性面積比均升高(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腹膜厚度及LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin陽性面積比比較(±s)

表1 各組大鼠腹膜厚度及LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin陽性面積比比較(±s)

注:1.LC3-Ⅱ,微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ;α-SMA,α-平滑肌肌動蛋白;E-cadherin,上皮鈣黏素。2.與假手術組比較,▲P＜0.05,與模型組比較,*P＜0.05;與中藥高劑量組比較,＃P＜0.05。

組別 只數腹膜致密層厚度(μm) LC3-Ⅱ(%) Beclin-1(%)假手術組 12 5.83±2.65* 3.61±0.72* 3.87±0.65*模型組 10 58.71±6.53＃▲ 23.32±2.72＃▲ 19.84±3.31＃▲西藥組 12 31.34±3.28*＃▲ 13.46±2.61*＃▲ 14.85±2.93*＃▲中藥低劑量組 11 40.88±5.72*＃▲ 14.84±3.56*＃▲ 15.73±2.49*＃▲中藥高劑量組 9 19.58±4.45*▲ 8.63±2.32*▲ 7.92±1.92*▲組別 只數 α-SMA(%) E-cadherin(%)假手術組 12 4.62±0.87* 8.73±0.92*模型組 10 22.30±2.15＃▲ 1.23±0.52＃▲西藥組 12 14.92±1.22*＃▲ 2.26±0.46*＃▲中藥低劑量組 11 16.10±2.12*＃▲ 2.83±0.87*＃▲中藥高劑量組 9 9.23±1.76*▲ 4.72±0.45*▲

3.4 腹膜LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白表達比較 與假手術組比較,模型組LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白表達水平均升高,E-cadherin蛋白表達水平均降低。與模型組、西藥組、中藥低劑量組比較,中藥高劑量組LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA蛋白表達水平均降低,E-cadherin水平均升高。見圖2。

圖2 各組大鼠腹膜組織LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA、E-cadherin蛋白電泳圖

3.5 電鏡下各組大鼠PMC自噬體比較 與假手術組比較,模型組PMC中自噬體數量顯著增加,自噬水平明顯上調。與西藥組、模型組、中藥低劑量組比較,中藥高劑量組PMC中自噬體數量顯著減少,自噬水平明顯下調。見圖3。

圖3 電鏡下各組大鼠腹膜間皮細胞自噬體形成情況

4 討論

EMT是PD相關性纖維化初始階段的主要病理變化,主要特征是正常PMC結構改變,轉化為成纖維細胞[8]。PMC是構成腹膜的主要細胞,相關研究表明,PMC損傷在EMT過程中起重要作用[9]。當腹腔穩態失衡發生PMC損傷時,PMC可以發生EMT,變成肌纖維母細胞,成為腹膜組織中成纖維細胞的來源。自噬是一種真核細胞程序性死亡形式,廣泛參與真核生物的生命過程。相關研究表明,自噬與EMT存在密切關系,但結論存在爭議[10]。本課題組前期研究發現,健脾益氣方能干預PD大鼠微炎癥狀態,保護大鼠PMC結構和功能,延緩PF進程[11],但健脾益氣方是否能通過調控PMC自噬,進而干預PMC的EMT進程,目前尚不明確。

《素問·熱論》中提出“脾主大腹”理論,指出腹膜的結構和功能與脾密切相關。殷玲等[12]及朱淑瑜等[13]研究結果均顯示,PD初期以脾腎氣虛證為主。基于此,筆者認為“脾氣虧虛”是PD相關性腹膜早期病變的主要病機[14],故防治PD早期誘導的腹膜損傷應從脾胃入手。健脾益氣方具有健脾益氣、理氣和絡的功效,方中黃芪、黨參益氣健脾為君,白術、茯苓健脾燥濕為臣,葛根、川芎、丹參升陽理氣活血為佐,炙甘草調和諸藥,大腹皮引諸藥入腹絡為使[15]。有報道指出,LC3、Beclin-1等作為細胞自噬體形成的標志,可以通過調節自噬強弱參與多種惡性腫瘤的發生及進展過程[16-17]。本研究采用5/6腎切除聯合4.25%腹膜透析液建立尿毒癥PD大鼠模型,觀察健脾益氣方對大鼠PMC自噬及EMT的影響。結果顯示,模型組大鼠LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA表達水平明顯高于假手術組,E-cadherin表達水平明顯低于假手術組,提示PD可誘導PMC的EMT,且PMC自噬可能參與PMC的EMT發生發展過程。健脾益氣方干預后,LC3-Ⅱ、Beclin-1、α-SMA表達水平降低,E-cadherin表達水平升高,表明健脾益氣方可能通過影響PMC自噬干預EMT進程,進而保護腹膜功能。

綜上所述,自噬激活參與PD相關性PMC的EMT發生發展過程,健脾益氣方可以明顯下調PMC自噬水平,起到抑制PMC的EMT,保護PD大鼠腹膜的作用。本研究初步驗證健脾益氣方可干預PD大鼠PMC病變進程,但存在一定不足,如在PD模型制備方面,大鼠需要進行二次手術及反復穿刺注射腹膜透析液,手術、穿刺損傷出血及實驗人員操作等因素均可影響實驗結果。在中醫證型方面,本研究將PD大鼠辨為脾氣虧虛證,但模型構建后其內在病理和外在癥狀是否存在對應關系尚未明確,今后的研究應注重中醫證型與動物模型的匹配問題。此外,健脾益氣方調控PMC自噬及EMT的具體機制仍不明確,今后將針對以上問題進行深入探索。