黃化茶樹黃金菊的葉綠體結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察

江新鳳，李 琛，曹揮華，王治會，江和源，董春旺，倪德江，童忠飛*

（1.江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所/江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330043；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

黃金菊是江西省選育的特異性茶樹資源［1］，來源于修水縣寧州群體，與已經(jīng)鑒定的國家良種寧州2號同屬一類，為寧州群體種中表現(xiàn)優(yōu)異的單株選育而來。尚未經(jīng)過國家審（鑒、認(rèn)）定，也未進(jìn)行品種登記，該品種在江西種植面積較大［2］，許多茶樹新品系的選育均以該品系為母本或父本，該資源特色鮮明，但在全國范圍內(nèi)受到的關(guān)注很少，目前對于這一品種新梢黃化形成的機(jī)理尚未完全清楚［3］。江新鳳等［4］在2021年對茶樹資源黃金菊開展了植物學(xué)特性、適應(yīng)性、適制性等方面的研究，探究了黃金菊茶樹新梢黃化的生理、生化和分子機(jī)理，為江西茶樹種質(zhì)資源的選育提供了重要的數(shù)據(jù)資料，為光敏黃化品種栽培、種植等提供了理論基礎(chǔ)。前人對其他作物研究表明，作物芽葉黃化通常與葉綠素合成受阻有關(guān)［5-10］。也有研究發(fā)現(xiàn)茶樹白化性狀中葉綠體結(jié)構(gòu)變化較大［11-13］（圖1）。茶樹黃金菊在正常光照情況下，待嫩梢成熟，葉色與寧州2號葉色無異，那么，黃金菊黃化的機(jī)理到底怎么樣？其萌發(fā)過程中哪些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化？關(guān)于這些問題的研究鮮見報(bào)道。本文以寧州2號為對照，對黃化茶樹黃金菊進(jìn)行80%遮蔭處理，待黃化茶樹轉(zhuǎn)為接近對照品種葉片葉色時(shí)，對各試驗(yàn)處理進(jìn)行了葉綠素、SPAD值以及亞細(xì)胞透視電鏡的觀察，以期進(jìn)一步揭示黃化茶樹黃金菊的黃化機(jī)理。

圖1 黃金菊芽葉萌發(fā)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地

試驗(yàn)茶樹種植區(qū)域位于115°59′45.3″E，28°22′3.4″N，海拔50～55 m。該區(qū)域茶園土壤為紅壤土，2017年測得茶園土壤pH值為4.06，有機(jī)質(zhì)19.70 g/kg，全氮1137.00 mg/kg，全磷0.63 g/kg，全鉀14.22 g/kg，水解性氮100.20 mg/kg，有效磷50.50 mg/kg，速效鉀169.00 mg/kg，交換性鎂0.42 mmol/kg，交換性鈣1.20 mmol/kg。

1.2 試驗(yàn)茶樹及取樣

以黃金菊為研究材料，寧州2號為對照品種，試驗(yàn)茶樹樹齡均為20周年，長勢良好。2018年4月10日開始對黃金菊茶樹進(jìn)行遮蔭處理，遮蔭措施：于茶行邊每隔3 m駐直徑20 mm鋼管，離地面高1.8 m，處理長度15 m，寬6 m，于頂部及周邊垂直到地面覆蓋遮光率80%的遮蔭網(wǎng)（用2層4針黑色遮陽網(wǎng)覆蓋），定期觀測黃金菊自然光照處理（NS）、遮蔭處理（S）和對照品種寧州2號（CK）的表型性狀。2018年6月10日，各試驗(yàn)處理間產(chǎn)生明顯

表型性狀變化，按茶樹組織超微結(jié)構(gòu)取樣要求，采摘茶樹品種自然光照黃金菊、遮蔭處理黃金菊、對照品種寧州2號的第2葉、第4葉，送至中國科學(xué)院武漢病毒研究所進(jìn)行TEM電鏡檢測，同時(shí)采用葉綠素儀分別測定各處理SPAD值（n=100），并測定各處理的葉綠素a、葉綠素b等成分含量。

1.3 測定方法

1.3.1 葉綠素含量測定 稱取0.2 g茶樹鮮葉（去梗去主脈），剪碎放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉，3 mL 5%乙醇，充分研磨成勻漿，再加入10 mL乙醇，充分研磨直至組織變白。避光，靜置5 min后過濾到25 mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至25 mL，搖勻。以95%乙醇為空白，分別在波長663、645、470 nm下測定吸光度［13］。

葉綠素a含量（Chla）、葉綠素b含量（Chlb）、類胡蘿卜素含量（Car）的計(jì)算公式為：

式中，m為葉片質(zhì)量（g）。

1.3.2 透射電鏡觀察 樣品處理參照Wei等［14］的研究方法。待樣品包埋好后，用EM UC7（德國Leica公司生產(chǎn)）超薄切片機(jī)切成60～100 nm的切片，鉛和鈾雙染色后在Tecnai G220 TWIN （美國FEI公司生產(chǎn)）電鏡下面觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃金菊遮蔭前后表型變化及葉綠素相對含量比較

相比較于寧州2號，黃金菊春季茶芽逐漸萌發(fā)，芽為橙紅色，第1葉為淺紫色，第2葉呈現(xiàn)部分黃色。盛夏階段，隨著光照強(qiáng)度的加強(qiáng)，黃金菊的黃白色芽葉表型充分發(fā)展，這種現(xiàn)象在以往對黃金菊研究中已有報(bào)道［1-4］，但是由于光照太強(qiáng)，有些幼齡茶樹嫩梢容易出現(xiàn)灼傷等現(xiàn)象，成齡茶樹或試驗(yàn)茶樹及綠葉、對照茶樹、遮蔭茶樹均會出現(xiàn)如此現(xiàn)象。至秋冬季節(jié)，黃金菊茶樹呈現(xiàn)返綠現(xiàn)象。隨著嫩梢成熟，先從嫩梢下部葉片開始返綠，自下而上葉片逐步由淺綠色返回到深綠色。通過在高于茶樹樹冠30～40 cm處覆蓋80%黑色遮蔭網(wǎng)，從而實(shí)現(xiàn)對茶樹黃金菊的遮光處理，遮蔭后黃金菊的表型性狀的變化（圖1）。結(jié)果表明，遮蔭后黃金菊茶樹新梢不會呈現(xiàn)自然光照下顏色變化的3個(gè)階段，該試驗(yàn)也能證明，黃金菊茶樹也屬于光照敏感性茶樹資源。

圖2 遮蔭處理后茶樹的芽、葉等生長情況

由表1可知，遮蔭后黃金菊第2葉的Chla含量、Chlb含量、類胡蘿卜素含量、SPAD值分別為0.89 mg/g、0.23 mg/g、475.51 mg/g、31.24，比自然生長黃金菊的各指標(biāo)分別提高了102.27%、155.56%、38.01%、58.90%，遮蔭后色素含量呈現(xiàn)出顯著性變化趨勢（P＜0.05），SPAD值提高了59.08%。遮蔭處理的Chla含量、Chlb含量、類胡蘿卜素、SPAD值與對照品種寧州2號的差異顯著（P＜0.05）。對照品種寧州2號的Chla含量、Chlb含量、類胡蘿卜含量、SPAD值分別比遮蔭處理提高了71.91%、130.43%、68.34%、48.43%。可見遮蔭后黃金菊第2葉復(fù)綠過程中，葉綠素等物質(zhì)代謝明顯，但未達(dá)到寧州2號的綠化水平。

表1 試驗(yàn)茶樹第2葉色素含量變化情況

由表2可知，遮蔭處理第4葉的Chla含量、Chlb含 量、Car含 量、SPAD值 分 別 為1.99 mg/g、1.04 mg/g、936.12 mg/g、54.32，比自然生長黃金菊的各指標(biāo)分別提高了36.30%、33.33%、11.74%、31.91%。遮蔭處理的Car含量、SPAD值與自然光照處理的有顯著性差異（P＜0.05），Chla、Chlb含量在遮蔭后有提高，但差異不明顯。寧州2號的Chla含量、Chlb含量、Car含量、SPAD值分別與遮蔭處理的相差不大，且組間無顯著性差異。可見在遮蔭后黃金菊第4葉復(fù)綠過程中，葉綠素等物質(zhì)代謝迅速，與寧州2號第4葉綠化水平無異。

表2 試驗(yàn)茶樹第4葉色素含量變化情況

2.2 遮蔭對黃金菊葉綠體結(jié)構(gòu)的影響

生長環(huán)境尤其是光照強(qiáng)度對新梢芽葉的顏色起到?jīng)Q定性的作用，當(dāng)對自然生長的茶樹黃金菊進(jìn)行遮蔭處理后，其新梢伸展發(fā)育成熟，葉片黃化程度逐漸減輕，綠色逐漸加重。取黃金菊成熟葉片（不同葉位）去葉脈的植物組織，經(jīng)制樣后置于TecnaiG220 TWIN透射電鏡下觀察葉片組織的葉綠體結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3、圖4所示。對照品種寧州2號、遮蔭處理的黃金菊的第2葉、第4葉有典型細(xì)胞、線粒體和葉綠體結(jié)構(gòu)，近橢圓形或者圓形的葉綠體貼細(xì)胞壁生長于細(xì)胞內(nèi)，葉綠體內(nèi)具有類囊體、嗜鋨顆粒以及緊密堆疊而成的基粒；而自然光照條件下黃金菊的第2葉、第4葉中葉綠體具有類囊體、嗜鋨顆粒和基粒，但是緊密堆疊的基粒片數(shù)量較少，葉綠體和細(xì)胞有膨脹趨勢而且體積較大，葉綠體內(nèi)充滿了氣泡，細(xì)胞內(nèi)可見葉綠體數(shù)量少，類囊體緊密度不及遮蔭處理的黃金菊和對照品種寧州2號的。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，遮蔭處理的第2葉、第4葉葉綠體數(shù)量、片層堆疊明顯多于自然光照條件，至第4葉時(shí)基本接近CK，甚至葉綠體的數(shù)量要多于對照品種寧州2號的。這也說明，黃金菊黃化可能主要與葉綠體數(shù)量、葉綠體的片層結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

圖3 自然光照和遮蔭處理茶樹第2葉電鏡圖

圖4 自然光照和遮蔭處理茶樹第4葉電鏡圖

3 討論與結(jié)論

一般情況下，黃化或者白化茶樹品種的氨基酸含量高于普通綠茶，而酚類物質(zhì)含量較低［13］，這也是使得黃化或者白化茶樹滋味更加鮮爽，口感為更多消費(fèi)者所接受的原因之一。Wei等［14］通過采集不同地區(qū)的綠茶春季樣品來研究氣候條件和葉綠素相對含量對茶葉品質(zhì)的影響，推測適度低溫、較低的葉綠素含量會形成較好的綠茶品質(zhì)，說明培育低葉綠素品種可以作為改良茶葉品質(zhì)的一條途徑，但葉綠素相對含量過低也會對茶樹生長造成影響，完全無法合成葉綠素的茶樹在苗期就可能死亡［15］。過去對白化茶樹品種白葉1號、白雞冠研究較多［16］，如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹育種團(tuán)隊(duì)研究了白葉1號茶樹白化—返綠過程中色素蛋白復(fù)合體的改變情況［17］，結(jié)果表明，白葉1號白化期間葉片中保留在捕光葉綠素蛋白復(fù)合體中的色素很少。顯微鏡掃描白葉1號成熟葉片發(fā)現(xiàn)，白化期內(nèi)膜系統(tǒng)逐漸解體［18］。白葉1號全白時(shí)期，所有葉肉細(xì)胞中葉綠體結(jié)構(gòu)完全解體［19］。吳金全［20］研究了白雞冠白化前和返綠后的變化情況，結(jié)果表明其葉綠體結(jié)構(gòu)和正常品種的差異不明顯；由于短期低溫環(huán)境（20 ℃左右）的影響，溫度敏感型茶樹葉綠體片層結(jié)構(gòu)受到破壞，葉綠體正常代謝發(fā)育、生物合成受阻，進(jìn)而產(chǎn)生白化植株。

在本試驗(yàn)中，作者以寧州2號為對照，采用了透射電鏡技術(shù)比較了黃金菊遮蔭前后第2葉、第4葉色素含量、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、葉綠體變化的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：遮蔭后黃金菊色素含量增加迅速，葉綠體數(shù)量增加、葉綠體結(jié)構(gòu)完整，沒有出現(xiàn)葉綠體解體及大量囊泡，但葉綠體中基粒片層堆疊明顯少于寧州2號。通過比較說明，黃金菊茶樹黃化與葉綠體中基粒片層合成減弱有關(guān)，但葉綠體損失不及白葉1號、白雞冠嚴(yán)重［19-20］。這解釋了黃金菊黃化而不白化，同時(shí)氨基酸含量不夠高、酚類物質(zhì)不低的原因［13，16］。本研究發(fā)現(xiàn)黃金菊黃化可能與光脅迫情況下葉綠體數(shù)量的減少、葉綠體基粒片層堆疊不緊密或減少有關(guān)系。

本文以黃金菊為研究材料，選擇寧州2號為對照品種。通過比較黃金菊茶樹遮蔭前后表型性狀、色素含量、SPAD值以及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化，可以判斷黃金菊屬于光敏型黃化茶樹資源，正常生長的黃金菊茶樹由于受到光脅迫以致細(xì)胞中的葉綠體數(shù)量少、發(fā)育不完全，甚至葉綠體基粒片層堆疊不緊密等原因，是導(dǎo)致該茶樹黃化的直接原因。相關(guān)現(xiàn)象的產(chǎn)生對黃金菊物質(zhì)代謝、品質(zhì)性狀是否有調(diào)控作用，其機(jī)制是什么還需進(jìn)一步分析。本研究為后續(xù)江西省深入研究黃色或白色茶樹產(chǎn)生，研究該變化的機(jī)理打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。