雞源大腸桿菌ΔcpxR的構建及生物學特性研究

劉志歡，宋雪艷，謝翠萍，陶夢珂，張魯星，李苗苗，劉建華

（河南農業大學 動物醫學院，河南 鄭州 450000）

禽致病性大腸桿菌可引起禽的多種大腸桿菌疾病，如氣囊炎、心包炎、敗血癥，給養禽業帶來巨大損失，又因為其與引起新生兒腦膜炎的大腸桿菌和引起尿道致病性的大腸桿菌基因具有高度同源性，開展相關研究具有較強的公共衛生意義［1-2］。大腸桿菌的血清型眾多，疫苗交叉保護性較差，需要藥物預防和治療，但是在不合理使用抗生素的情況下，極易導致大腸桿菌產生耐藥性。

細菌內部存在著許多復雜的調控網絡來應對周圍環境的變化，以適應生存。雙組分調控系統是組氨酸激酶活性的膜定位傳感器和細胞質反應調節器組成的表達調節系統，已經發現具有調控細菌耐藥性的有CpxAR、PhoPQ和BaeSR等［3-4］。CpxAR是典型的雙組分調控系統，部分細菌還具有附屬調節蛋白cpxP，組氨酸蛋白激酶cpxA通過感受外界變化使自身磷酸化，再將信號傳導給反應調節蛋白cpxP［5］，從而使細菌適應外界環境。最早認為該系統作用于細菌膜結構蛋白，后來又有研究發現，感知細菌膜表面的壓力信號，調控菌毛和分泌系統，有助于細菌快速適應環境，進而調控細菌的生存機制［6］。

本實驗室在大腸桿菌標準菌株中，成功構建了cpxR基因缺失株，在此基礎上，本研究通過Red同源重組技術，構建臨床雞源大腸桿菌E41 cpxR基因缺失株和回補株，比較與其野生株E41的部分生物學差異，從而為更好地研究雙組分系統在臨床耐藥菌株中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

雞源大腸桿菌E41由本實驗室分離鑒定，并進行全基因組測序（Genebank ID：CP069707.1）；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；pKD4是具有FRT位點的卡那霉素抗性基因的輔助性質粒、pKD46經L-阿拉伯糖誘導后能表達同源重組酶、pCP20用于消除FRT位點的卡那霉素抗性基因、pBAD/HisA用于構建回補株中的過表達載體，具有氨芐青霉素抗性，以上質粒由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器

質粒小量提取試劑盒購自美國OMEGA試劑公司；PrimeSTAR Max Premix、限制性核酸內切酶購自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA Ligase購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、L-阿拉伯糖購自北京索萊寶科技有限公司；PCR儀購自蘇州東勝興業科學儀器有限公司；電轉化儀和電泳儀購自Bio-Rad公司；凝膠成像系統購自英國Syngene公司。

1.3 引物設計

根據E41中cpxR基因及其上下游序列設計相關引物。P1、P2作為打靶片段引物，5′末端的部分序列與cpxR兩側序列同源，3′末端部分序列與pKD4中kanr基因兩側序列互補；P3、P4為缺失鑒定引物；P5、P6為檢測重組子菌株插入的kanr基因；另外，組合引物P3和P5驗證kanr基因插入位點上游片段，約1700 bp；組合引物P4和P6驗證kanr基因的插入位點下游片段，約1300 bp；P7、P8擴增cpxR的全基因長片段；P9、P10是帶有雙酶切位點的完整開放閱讀框。

表1 本研究所用引物

1.4 cpxR基因缺失株構建

參考Red同源重組方法［8］，將pKD46質粒以電轉的方式轉入到E41感受態細胞中，得到E41-pKD46。以pKD4質粒為模板，引物P1、P2擴增，膠回收得到cpxR基因的打靶片段。將打靶片段電轉到E41-pKD46感受態細胞中，過夜培養挑取陽性克隆子ΔcpxR:kan。然后將pCP20質粒電轉到陽性克隆子中，擴增培養后，用缺失鑒定引物鑒定克隆子，并送測序。陽性克隆子鑒定并命名為ΔcpxR。

1.5 cpxR基因回補株構建

以E41的DNA為模板，引物P7、P8擴增cpxR的全基因長片段。再以PCR產物為模板，用P9、P10引物擴增含有Sac I和Hind III雙酶切位點的cpxR完整開放閱讀框。對PCR產物和pBAD/HisA質粒分別進行雙酶切。膠回收酶切產物，然后用T4 DNA Ligase 4 ℃過夜連接。連接產物用化學轉化的方法轉入到DH5α感受態細胞中，提取重組子質粒雙酶切驗證。將陽性克隆子電轉到ΔcpxR感受態細胞中，即得到回補菌株CΔcpxR。

1.6 生長曲線和運動能力測定

分別挑取E41、ΔcpxR、CΔcpxR單菌落培養至D600=0.6，以1∶100的比例轉接到肉湯中，37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養，每隔1 h測定D600值。待D600=1.0左右時，各取5 μL菌液垂直滴加在含有0.5%瓊脂的半固體LB平板上，37 ℃培養12 h后，測量菌圈直徑。

1.7 生物被膜形成能力測定

將新鮮菌液稀釋至D600=0.1［9］，取200 μL加入到96孔培養板中，28 ℃培養48 h。小心棄去培養基，用PBS輕洗3次后加入200 μL的結晶紫溶液染色20 min。棄去結晶紫溶液，用去離子水清洗3遍，然后用95%乙醇充分溶解，在酶標儀上測定D580的值。

1.8 缺失株穩定性測定

挑取缺失株ΔcpxR單菌落于LB肉湯中［10］，每隔5 d傳一次代，一直持續15 d。將每次傳代的菌液提取DNA，用缺失鑒定引物P3、P4擴增后，電泳檢測缺失株ΔcpxR穩定性。

1.9 各菌株MIC的測定

根據微量肉湯稀釋法［11］測定12種常用抗菌藥物對E41、ΔcpxR、CΔcpxR的最小抑菌濃度。以大腸桿菌ATCC25922為質控菌株，每個平行重復3次。在37 ℃ 培養箱中培養 16 h，觀察結果，讀取最小抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 缺失株ΔcpxR的鑒定

分別用缺失鑒定引物P3和P4、P5和P6，組合引物P3和P5、P4和P6進行PCR擴增驗證，均出現預期大小的目的條帶（圖1），將得到的重組子標記為ΔcpxR:kanr，再以ΔcpxR:kanr、ΔcpxR的DNA為模板，缺失鑒定引物P3、P4擴增cpxR基因，得到符合大小的目的條帶（圖2），表明成功構建出缺失株ΔcpxR。

圖1 菌株ΔcpxR:kanr的PCR鑒定結果

圖2 菌株ΔcpxR和臨床野生株E41的PCR鑒定結果

2.2 回補株CΔcpxR的鑒定

將cpxR的完全開放閱讀框連接到pBAD/HisA載體并通過化學轉化的方式轉入DH5α感受態細胞中，提取重組子質粒，進行雙酶切驗證，證實得到cpxR-pBAD/HisA重組質粒（圖3）。將陽性克隆子電轉到ΔcpxR感受態細胞中，即得到回補菌株CΔcpxR。

圖3 cpxR重組質粒的雙酶切鑒定

2.3 生長曲線和運動性測定

E41、ΔcpxR、CΔcpxR在37 ℃、200 r/min的情況下震蕩培養，每隔1 h測D600的值，繪制成圖4。用游標卡尺測量各菌株在半固體LB瓊脂上的菌圈直徑，繪制成圖5。上述結果顯示，cpxR基因缺失不影響E41的生長速度和運動能力。

圖4 各菌株生長曲線

圖5 各菌株的運動距離

2.4 生物被膜形成能力

在最適溫度28 ℃中培養48 h后，用酶標儀檢測D580處的吸光度。根據測定結果繪制成圖6。結果顯示，cpxR基因缺失對其生物被膜的形成能力影響不顯著。

圖6 生物被膜形成能力測定

2.5 缺失株穩定性

利用缺失鑒定引物擴增傳代缺失株，不同時間傳代菌株均可擴增出目的條帶，未發生異常突變，表明缺失株具有良好的傳代穩定性。

圖7 缺失株穩定性測定

2.6 cpxR基因對藥物敏感性的影響

根據歐盟藥敏試驗標準判定實驗結果，結果顯示，與E41相比，缺失株ΔcpxR對鏈霉素和多西環素的MIC值提高2倍，對氟苯尼考的MIC降低至原來的1/2?；匮a株CΔcpxR對多西環素和氟苯尼考恢復至E41一致水平。以上結果表明，cpxR基因參與了細菌對以上藥物敏感性的調控。

表2 各菌株對抗生素的MIC測定結果 μg/mL

3 討論

雞源大腸桿菌主要引起家禽呼吸系統和消化系統疾病，也會與其他病原菌共同作用，造成家禽混合感染，給養殖業帶來巨大損失。人們發現了許多調控系統參與了感染過程，如雙組分調控系統、群體感性系統以及外排泵系統等。其中，雙組分調控系統可以感應外界環境變化，通過激酶和響應調節器傳導相關信號，調節細菌生理代謝、應激反應和致病性等［12］，有利于細菌生存。作為典型的雙組分調控系統，CpxAR雙組分調控系統可以調控革蘭氏陰性桿菌的細胞膜抗逆性、細胞壁完整性、細菌耐藥性及調控毒力基因［13-15］。本研究利用Red同源重組技術構建cpxR基因缺失株和cpxR回補株，探究cpxR基因對禽源大腸桿菌的生物學特性和耐藥性的影響。

本研究發現，cpxR基因的缺失不影響雞源大腸桿菌的生長速度、運動能力以及生物被膜形成能力。馮芬芬［16］發現cpxR基因的缺失不影響副豬嗜血桿菌的生長速度和生物被膜形成能力，另外，吳同壘等［17］發現缺失cpxR基因不影響沙門菌的生長速度。Matter等［18］在研究中指出，高水平的磷酸化cpxR可能抑制鞭毛和運動基因的轉錄，當cpxR基因缺失時，這種抑制作用就得不到表達，導致缺失株和回補株在運動能力、生物被膜形成能力上無明顯差異，本研究的結果與以上結果基本一致。

cpxR基因可以影響細菌對某些藥物的敏感性，例如當沙門菌缺失cpxR基因后，對氨基糖苷類和β-內酰胺類藥物的敏感性升高［19］。在本次研究中發現了類似的現象，cpxR基因缺失后，對鏈霉素敏感性發生了變化。Masi等［20］認為CpxAR雙組分系統調控的外膜蛋白受到了影響，因此氨基糖苷類藥物鏈霉素的敏感性發生了變化。Kurabayashi等［21］研究發現cpxR基因參與了細菌對磷霉素的調控，認為缺乏磷酸酶活性的cpxA突變體會激活cpxR導致磷霉素耐藥，對多西環素和氟苯尼考敏感性的機制還需進一步探究。

通過對野生株E41、缺失株ΔcpxR、回補株CΔcpxR的比較，發現cpxR基因的缺失不影響野生株E41的生物學特性，但是影響了對抗生素的敏感性。本研究成功構建了雞源大腸桿菌cpxR基因缺失株，為接下來在臨床野生株中構建其他基因缺失株提供參考，也為后續研究cpxR基因功能提供了工程菌株。