7株橡膠樹膠孢炭疽菌拮抗放線菌的分離及拮抗活性初步評(píng)價(jià)

王 蕊，王麗娟，和桂青，侯志江，和加衛(wèi)，李兆光，李 燕，和瓊姬

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674100）

膠孢炭疽菌（Colltootrichum gloeosporioides）是半知菌類、刺盤孢屬的一種真菌，是熱帶、亞熱帶國家最常見的炭疽菌總?cè)海翘烤覍賰?nèi)最大的一個(gè)種群［1］。膠孢炭疽菌種類繁多，寄主范圍廣泛，可以侵染橡膠、香蕉、荔枝等重要的經(jīng)濟(jì)作物，在生長過程中引起較嚴(yán)重的炭疽?。?］。

膠孢炭疽菌的致病性較強(qiáng)，是引起橡膠樹炭疽病的主要病原，而橡膠炭疽病是橡膠樹常發(fā)病害之一，在橡膠的種植區(qū)分布較廣［3］，對(duì)小樹苗、幼樹、成齡膠樹都能產(chǎn)生危害［4］。橡膠炭疽病致使橡膠樹的葉片組織大量壞死、葉片大量掉落、樹體弱化，同時(shí)還會(huì)縮減割膠的時(shí)間限期，最終會(huì)導(dǎo)致橡膠產(chǎn)量的明顯下滑。而且我國每年因橡膠炭疽病侵染危害的橡膠樹種植面積高達(dá)2萬hm2以上，由此導(dǎo)致了干膠產(chǎn)收損失近萬噸，嚴(yán)重影響了我國橡膠產(chǎn)業(yè)及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展［5］。

目前，橡膠樹炭疽病的防治以化學(xué)防治為主，常選用噻菌靈等苯并咪唑類農(nóng)藥和咪鮮胺等麥角甾醇類生物合成制劑及其復(fù)配劑等［6］。然而，長期使用農(nóng)藥，易導(dǎo)致病害防治效果不理想并產(chǎn)生抗藥性等問題，同時(shí)，農(nóng)藥會(huì)造成土壤污染及水資源污染，嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境［7］。生物防治因具運(yùn)用便捷、高效［8］、耗能低，而且對(duì)植物本身和環(huán)境均相對(duì)安全，防治效果明顯、不易導(dǎo)致抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，成為如今各類植物病害綠色綜合防控研究中的重點(diǎn)和熱點(diǎn)［9］。

放線菌因能對(duì)許多細(xì)菌和真菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，常用于生物防治。放線菌在自然界中分布廣泛，主要存在和分布于土壤、海洋、動(dòng)植物體等多元的環(huán)境中，具有關(guān)鍵的生態(tài)學(xué)功能［10］。研究表明：利用土壤中的拮抗放線菌來控制植物病害發(fā)生已在眾多重要經(jīng)濟(jì)作物病害的防治中得到廣泛的研究和應(yīng)用［11］。

本研究對(duì)采自甘肅省嘉峪關(guān)七一冰川的土樣進(jìn)行放線菌的分離，以膠孢炭疽菌等共5種病原真菌為靶標(biāo)菌，對(duì)分離到的放線菌進(jìn)行拮抗活性測(cè)定。旨在篩選出能產(chǎn)生某些抗菌物質(zhì)并可用于生物防治的有益菌株，并為進(jìn)一步研究和開發(fā)創(chuàng)新生物防治技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤來源 采自甘肅省嘉峪關(guān)的七一冰川。

1.1.2 供試植物病原真菌 膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp. cubense）、火龍果潰瘍病菌（Neoscytalidium dimidiatum）、芒果蒂腐病菌（Dothiorella dominicana），均由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 高氏1號(hào)培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基，具體配方詳見文獻(xiàn)［1］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 放線菌菌株的分離與純化 （1）土壤樣品的采集。釆集土樣時(shí)，先鏟去表層土，挖5～10 cm深度的土壤并裝入無菌牛皮紙帶內(nèi)，封好袋口并做好標(biāo)記［12］。將采集樣本帶回實(shí)驗(yàn)室混合過篩，自然風(fēng)干7～10 d后再進(jìn)行分離操作［13］。

（2）土壤稀釋液的制備。稱取10 g土樣，研磨至粉末狀后，將土樣粉末倒入含90 mL無菌水和少量玻璃珠的錐形瓶中，在28 ℃、160 r/min條件下振蕩20 min，即成10-1濃度的土壤懸液。靜置片刻后，進(jìn)行梯度稀釋，用移液槍吸取上層溶液1 mL至裝有9 mL的無菌水試管中，混合均勻，制成10-2稀釋液，依次制成10-3和10-4土壤稀釋液［14］。

（3）稀釋涂布法分離放線菌。取出制備好的土壤稀釋液，用移液槍分別從濃度為10-2、10-3和10-4的土壤稀釋液中吸取100 μL稀釋液，均勻涂布于高氏1號(hào)平板上，于28 ℃條件下倒置培養(yǎng)7 d。

放線菌菌落的特征：不濕潤、較干、小型、不透明、表面呈致密的絲絨狀，上覆有一層“干粉”；菌落和培養(yǎng)基之間的連接較為緊密，不易挑取；菌落的正反兩面通常會(huì)呈現(xiàn)出不同的顏色［15］。

（4）菌株的純化。采用平板劃線分離法純化菌株。用接種環(huán)挑取平板上的單菌落分別至高氏1號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，于28 ℃條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌落的生長情況，待有單菌落長出后備用。

1.2.2 拮抗放線菌的初篩 采用平板對(duì)峙法進(jìn)行初篩。將分離出的放線菌以膠孢炭疽菌為靶標(biāo)菌，測(cè)定放線菌的抑菌活性，具體操作如下：用接種環(huán)挑取適量放線菌，在距培養(yǎng)皿中心2 cm處各畫一條貫穿培養(yǎng)皿的平行直線，再用直徑為5 mm的打孔器打取膠孢炭疽菌的菌餅，接種于平板中央；以只接病原菌菌餅的平板作為對(duì)照，于28 ℃條件下培養(yǎng)7 d后觀察，利用十字交叉法測(cè)量平板中菌落的直徑，并根據(jù)公式計(jì)算抑制率［16］。計(jì)算公式如下：

1.2.3 7株放線菌對(duì)4種病原真菌抑菌活性的測(cè)定 運(yùn)用1.2.2的方法，以膠孢炭疽菌為靶標(biāo)菌篩選出7株拮抗活性較強(qiáng)的放線菌，進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)其他4種病原真菌（香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、芒果蒂腐病菌和火龍果潰瘍病菌）的皿內(nèi)拮抗作用。

1.2.4 7株放線菌發(fā)酵液的制備 將放線菌菌株接種于高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，于28 ℃條件下培養(yǎng)7 d，待放線菌長出單菌落后，挑取單菌落接種于裝有10 mL LB培養(yǎng)基的離心管中。于28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d后，再按10%的接種量接種于裝有100 mL小米培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)12000 r/min離心5 min后得到菌體和發(fā)酵液2部分，發(fā)酵液備用。

1.2.5 7株放線菌發(fā)酵液活性的測(cè)定 取1 mL發(fā)酵液與10 mL PDA培養(yǎng)基（冷卻至55 ℃左右）混合，倒板，以只加10 mL PDA培養(yǎng)基的平板作為對(duì)照，將培養(yǎng)5～7 d的靶標(biāo)菌用打孔器打取直徑5 mm的菌塊，并接種于平板中央，3組重復(fù)。在28 ℃條件下培養(yǎng)，采用十字交叉法測(cè)定靶標(biāo)菌菌落直徑，根據(jù)公式（1）計(jì)算放線菌的抑制率。

1.2.6 菌株QY-26發(fā)酵液的制備及其對(duì)4種病原真菌抑菌活性的測(cè)定 制備菌株QY-26的發(fā)酵液，測(cè)定菌株QY-26對(duì)4種病原真菌（香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、芒果蒂腐病菌和火龍果潰瘍病菌）的拮抗作用。方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂布法分離放線菌的結(jié)果

通過稀釋涂布法、平板劃線分離法，從七一冰川土樣中共分離得到28株放線菌，并依次標(biāo)記為QY-1、QY-2、…、QY-28。并獲得多個(gè)獨(dú)立分布的單細(xì)胞［17］，為下一步試驗(yàn)作準(zhǔn)備。詳見圖1。

圖1 通過平板劃線法分離出的部分放線菌

2.2 放線菌對(duì)膠孢炭疽病菌皿內(nèi)拮抗活性的初篩

對(duì)分離出的28株放線菌采用平板對(duì)峙法進(jìn)行初篩后，得到7株拮抗活性較顯著的放線菌，編號(hào)分 別 為：QY-2、QY-8、QY-9、QY-13、QY-23、QY -26和QY-28。根據(jù)公式（1）計(jì)算，其抑制率分別為93.8%、79.3%、95.0%、41.3%、98.7%、88.8%、97.3%。其中，抑制率最高的是QY-23，其抑制率達(dá)98.7%。結(jié)果詳見圖2和表1。

圖2 部分放線菌對(duì)膠孢炭疽病菌皿內(nèi)拮抗活性初篩試驗(yàn)結(jié)果

表1 部分放線菌對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率 %

2.3 7株放線菌對(duì)4種病原真菌的抑菌活性

以膠孢炭疽菌為靶標(biāo)菌，初篩出抑菌活性較好的菌株為QY-2、QY-8、 QY-9、QY-13、QY-23、QY-26和QY-28。將這7株放線菌在皿內(nèi)測(cè)定其對(duì)香蕉炭疽病菌、火龍果潰瘍病菌、芒果蒂腐病菌和香蕉枯萎病菌這4種病原真菌的抑菌活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在7株放線菌中，菌株QY-2、QY-8、QY-9和QY-23對(duì)芒果蒂腐病菌的抑制率達(dá)100.0%；菌株QY-2、QY-26和QY-28對(duì)香蕉炭疽病菌的抑制率達(dá)100.0%；菌株QY-8和QY-23對(duì)火龍果潰瘍病菌的抑制率達(dá)100.0%；菌株QY-28對(duì)香蕉枯萎病菌的抑制率達(dá)100.0%。綜合分析，在7株放線菌中，QY-2的抑菌效果最好、抑菌譜最廣，抑制率最高為98.7%，最低為96.3%；而QY-13的抑菌效果最差，抑制率最高僅為49.3%。結(jié)果見圖3和表2。

表2 7株放線菌對(duì)4種病原真菌的抑制率 %

圖3 部分放線菌對(duì)4種病原真菌的皿內(nèi)活性測(cè)定結(jié)果

2.4 7株放線菌發(fā)酵液活性的測(cè)定

取適量發(fā)酵液制作玻片，通過顯微鏡觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)備用發(fā)酵液中有菌絲存在，可開展下一步試驗(yàn)操作。以膠孢炭疽菌為靶標(biāo)菌，對(duì)QY-2、QY-8、QY-9、QY-13、QY-23、QY-26和QY-28這7株放線菌進(jìn)行發(fā)酵液活性測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：QY-26、QY-8、QY-13和QY-28這4株放線菌發(fā)酵液具有活性，且抑制率分別為77.8%、48.9%、6.7%和4.8%。放線菌QY-2、QY-9、QY-23的抑制率則均為0。結(jié)果詳見圖4和表3。

表3 7株放線菌發(fā)酵液活性的測(cè)定 %

圖4 7株放線菌發(fā)酵液活性測(cè)定結(jié)果

2.5 菌株QY-26發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定

進(jìn)一步將菌株QY-26的發(fā)酵液對(duì)香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、火龍果潰瘍病菌和芒果蒂腐病菌進(jìn)行活性測(cè)定。結(jié)果表明：菌株QY-26除了對(duì)膠孢炭疽菌有較好的抑制作用外，對(duì)香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、火龍果潰瘍病菌和芒果蒂腐病菌也具有抑制作用，抑制率分別為77.8%、54.3%、54.0%和45.2%。結(jié)果詳見圖5和表4。

表4 菌株QY-26發(fā)酵液對(duì)4種病原真菌的皿內(nèi)拮抗活性

圖5 菌株QY-26發(fā)酵液對(duì)4種病原真菌的活性測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究以膠孢炭疽菌為靶標(biāo)菌，利用平板對(duì)峙法，對(duì)從甘肅省嘉峪關(guān)七一冰川土樣中分離的放線菌進(jìn)行皿內(nèi)活性測(cè)定，共得到QY-2、QY-8、QY-9、QY-13、QY-23、QY-26和QY-28這7株活性較強(qiáng)的放線菌。進(jìn)一步測(cè)定發(fā)現(xiàn)，這7株放線菌對(duì)香蕉炭疽病、香蕉枯萎病菌、芒果蒂腐病菌、火龍果潰瘍病病菌4種病原真菌都具有抑制作用。

再以膠孢炭疽菌為靶標(biāo)菌對(duì)這7株放線菌發(fā)酵液進(jìn)行活性測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：菌株QY-26、QY-8、QY-13和QY-28的發(fā)酵液具有一定抑菌活性。分析對(duì)比發(fā)現(xiàn)，菌株QY-26發(fā)酵液的抑菌活性最好。進(jìn)一步測(cè)定發(fā)現(xiàn)，菌株QY-26發(fā)酵液對(duì)香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、火龍果潰瘍病菌和芒果蒂腐病菌這4種病原菌具有不同程度的抑制作用。

綜合發(fā)現(xiàn)，菌株QY-26對(duì)于5種病原菌都具有一定的抑制作用，其中對(duì)膠孢炭疽菌的抑制作用最強(qiáng)。

3.2 討論

本試驗(yàn)在以膠孢炭疽菌為靶標(biāo)菌對(duì)放線菌進(jìn)行初篩時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌株QY-23活性最強(qiáng)，抑制率高達(dá)98.7%，但其發(fā)酵液活性檢測(cè)中抑制率卻為0。對(duì)此推測(cè)以下可能：（1）由于放線菌時(shí)間太長而已經(jīng)失活；（2）放線菌的活性物質(zhì)不存在于發(fā)酵液的上清液中，而是存在于離心后的沉淀物中；（3）培養(yǎng)基不適合該活性物質(zhì)生長；（4）傳代次數(shù)過多，導(dǎo)致活性物減少甚至完全喪失。

本試驗(yàn)以放線菌為基礎(chǔ)，通過試驗(yàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，因土壤中不僅具有放線菌還有細(xì)菌，整個(gè)試驗(yàn)過程中常伴有細(xì)菌污染現(xiàn)象，對(duì)此現(xiàn)象的原因分析和具體有效防止措施有待研究；或?qū)υ摲N細(xì)菌與被污染放線菌間是否具有相同習(xí)性或之間是否具有相關(guān)聯(lián)系進(jìn)行試驗(yàn)研究；或?qū)Ψ啪€菌菌株QY-26的發(fā)酵液中活性物質(zhì)進(jìn)行研究，對(duì)其發(fā)酵液的沉淀物中是否含活性物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)一步測(cè)定QY-26的抑制作用，以完善和開發(fā)其生物防治的效果，為進(jìn)一步開發(fā)創(chuàng)新生物防治技術(shù)提供理論依據(jù)。