CFS大鼠模型的建立與評價*

馬菲，張小凡，李華南,3△

（1.天津市中醫藥研究院附屬醫院，天津 300120；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193；3.國家中醫藥管理局推拿手法生物效應三級實驗室，天津 300193）

慢性疲勞綜合征作為一種臨床常見疾病，患者常表現出不可名狀的心理與生理性疲勞。除疲勞的主要癥狀外，患者還伴隨有記憶力下降或注意力不集中、咽喉腫痛、淋巴結大、肌肉酸痛、無紅腫的多關節疼痛、其他形式的頭痛、不能解乏的睡眠等。該病多發生于35～50歲之間的上班族，且女性發病率高于男性，給患者及家庭帶來了巨大的危害，學界一直在尋求有效的治療方案。近年來，中醫藥在該病的治療上取得了一定進展，特別是推拿療法的干預，使得患者的疾病得到了緩解與恢復。但限于其發病機制尚未明確，無法從病理實質上闡釋其作用途徑與干預機制；加之，CFS在臨床上尚無特異性檢測方法及診斷指標，其診斷主要依賴于醫生對于患者臨床表現的判斷[1]。因此，建立CFS動物模型，探究其相關標志物的特異性檢測能夠為臨床上針對CFS研究提供基礎實驗及技術支撐[2]。

目前，多數學者認為慢性疲勞綜合征的發生是機體面對應激時產生的慢性反應。應激作為一種非特異性全身反應，在機體遇到各種緊張性刺激物時所產生的交感神經-腎上腺髓質和下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統興奮反應的一種生理和心理反應。適度的應激能夠提高機體對于外界刺激的適應能力，維持細胞內外環境穩態；而過度的應激則會產生負面效應，引起人體的應激性相關疾病，CFS正屬于此列[3]。因此，基于以上考慮，學界逐漸在探索通過慢性應激刺激法來使得實驗動物產生一定的CFS疾病特征，達到建立CFS動物模型的目的。

CFS動物模型主要分為單一和復合應激模型兩種類型，兩種應激模型的區別在于應激的手段、刺激頻次、種類各有不同，但主要均通過建立孤獨、挫敗、恐懼環境及禁食水等多種模式、多種形式來建立動物心理及生理應激模型。研究過程中，可以根據實驗所需的動物選用不同應激反應類型以建立相應的動物模型[4]。這樣能夠更好地建立動物模型，了解各種干預手段，特別是中醫藥手段干預的效應途徑，為臨床與科學研究提供支持。

1 生理疲勞為主造模

1.1 游泳法

游泳法是最常用的疲勞造模方法，其具有易操作、可重復等優勢，得到許多學者的認可。其中，短時間冷水游泳法為達到軀體疲勞的刺激，將大鼠每日隨機時間在10℃的冷水中進行游泳運動，每次6～10min，通過體力消耗刺激、寒冷刺激、強制性精神刺激等多種應急因素對大鼠進行應激性刺激[5]；同時，為避免大鼠在實驗過程中對特定時間、頻率、強度的應激刺激產生適應性反應，實驗在每天的隨機時間開始，并隨機改變造模時間。長時間常溫游泳法主要為強迫大鼠游泳1次/日、25min/次、水溫22±2℃，連續游泳28天[6]；也有方法是讓大鼠一直在4℃的冷水中游泳30min[7]，將寒冷刺激及力竭游泳刺激強度均大大提高，但同時由于大鼠長期處于低溫環境和體力不支的狀態下，增加了動物造模的死亡率。上述造模實驗的時間不一，大致在7～21天不等。國外部分研究[8-10]建立了短時間常溫游泳法：強制大鼠在水池（25cm×12cm×25cm）中游泳6min，水深15cm，水溫22±3℃，連續7天進行大鼠游泳造模。大鼠在下水初期體力充沛，隨著游泳時間的增加，體力降低，會在水面漂浮，即四肢無游泳動作，頭部浮出水面。實驗人員在記錄大鼠游泳期間出現不游動的總時間，來判斷疲勞造模是否成功。大鼠在水下不動時間的狀態被認為與CFS特征相似。另外，還有負重力竭游泳：通過進行慢性負重力竭游泳法建立CFS大鼠模型：強制大鼠在水桶（深50cm）內進行其體質量5%的負重力竭游泳實驗，水溫30±2℃，1次/日，共游泳21天[11]。實驗過程中，當大鼠由于疲勞而不做游泳運動時，用木棍驅使其繼續游泳，直至大鼠游泳動作明顯不協調，且沉入水下10s而不能上浮作為達到力竭的標準。

近年來，針對CFS造模的方法多采用強制冷水游泳，其中包含了溫度、體力、精神等方面的刺激源。由于引起慢性疲勞的因素并非單一方面的生理因素，同時包括心理疲勞等也在起作用。因此，強制冷水游泳法不僅在軀體因素上進行體能消耗的刺激，也在強迫游泳活動中對動物施加了心理刺激。祖國醫學認為，過勞是引起疲勞的一個重要原因。強迫游泳造模法正是應用這一醫學理論，通過對大鼠施加長達數天的強制游泳運動，消耗大鼠體力，引起其四肢的倦怠、筋骨疲累。由于四肢過勞倦怠會影響大鼠脾胃消化功能，引起動物納食減弱，氣血生化減少，大鼠機能下降又進一步引起疲勞。而強制冷水刺激作為一種有害的精神刺激因素，既可引起動物的七情變動，也會引起運動疲勞，后文提到的跑臺同樣也是久行所傷。因此，強制冷水游泳法誘導的CFS模型能夠更加趨向于真實情況下引起的慢性疲勞。

1.2 跑臺法

跑臺法是一種運動性疲勞造模法。史麗萍等[12]創建了一種造模法，具體方法為：將實驗動物適應性飼養1周，正式實驗2天前，各小鼠每天進行5～10min的跑臺訓練，速度為0.17m/s，以熟悉跑臺。正式實驗開始，各組動物跑臺速度均為0.37m/s，過程中不斷采用聲觸刺激，建立小鼠力竭性運動疲勞模型。

2 心理疲勞為主造模

2.1 單因素刺激

2.1.1 慢性束縛 對實驗動物進行慢性應激性束縛實驗是一種非常經典且可操作性極強的應激造模方法[13]，也是建立疲勞型亞健康大鼠模型的常用造模方法，其操作簡單，對于實驗室的儀器要求低，可重復性強，可以高度模擬臨床慢性疲勞綜合征和疲勞型亞健康特征。該方法的主要原理主要是利用嚙齒類動物喜愛鉆洞的習性，將動物束縛在狹小空間內，并限制其活動，保證其正常呼吸。也有研究報道[14]，為避免實驗動物在實驗過程中對實驗規律產生適應性反應，因此每天的造模實驗時間可不固定，可在此實驗后每3天逐漸增加束縛時間，分別為1h、1.5h、2h、2.5h。慢性束縛實驗主要通過限制動物軀體活動及逐漸增加的應激強度，使動物產生煩躁、掙扎、憤怒、絕望等一系列負性情緒，導致大鼠軀體及精神疲勞的發生，高度模擬CFS發病的社會心理因素。通過慢性束縛實驗，動物大腦中海馬結構的氨基酸遞質的含量發生改變，導致中樞抑制占據優勢地位，引起動物的疲勞、記憶力下降、抑郁[15]。亦有其他學者對束縛工具、時間等進行了一些改良，如隨機選擇束縛實驗開始時間、自制玻璃材質的束縛管（束縛過程中不會產生額外的軀體傷害），以便更好地模擬產生心理疲勞效果[16-17]。

2.1.2 電刺激法 目前，除了慢性束縛，應用較多的是通過電刺激建立應激性疲勞狀態模型，主要包括正常狀態下電脈沖刺激和進食過程中給予電刺激兩種方法。有研究[18]給予大鼠波寬2ms的電脈沖，刺激電流強度為1mA，每天刺激15次，每次間隔20s。電刺激足底法：張俊慧等[19]通過將鹽水浸濕動物足底關節并固定電療帶，連接電針，頻率10Hz，強度1.5V，每次刺激10min，每天2次，共2周。進食電刺激法：主要是在大鼠進食時，使用電路板電刺激[20]。

2.1.3 夾尾刺激法 夾尾應激法是通過對雄鼠進行激怒刺激，造成其心理疲勞，具體操作方法為：每日下午用包裹紗布的止血鉗夾住大鼠尾部，刺激其與其他大鼠進行廝打，用以模仿人類在競爭壓力的社會環境下的應激狀態。該刺激每次持續刺激2h，連續刺激21天[7]。實驗時應避免尾部出現傷口、出血現象。

2.1.4 其他 除上述方法外，還有睡眠剝奪法：實驗動物每日進行睡眠剝奪20h，持續13天[21]。腎上腺皮質激素應用-停藥法[22-24]：用醋酸氫化可的松注射液予以大鼠肌內注射，起始劑量為24.4～62.5mg/kg，用藥期為3～14天，停藥期為3～13天；或醋酸可的松注射液肌內注射，劑量為13.9～27.8mg/kg，用藥期為7～17天，停藥期為2～7天；以及懸吊法等造模方法，但相對應用較少。

2.2 復合因素刺激

韓娟[25]通過旋轉、限制、擁擠三種方法對大鼠進行刺激模擬心理應激。旋轉實驗：將老式唱片機調節轉速至45次/min，每日隨機選擇開始時間給予大鼠旋轉刺激，為避免動物發生適應性反應，將實驗次數設定為第1周1次/天，第2周2次/天，第3周1次/天，15min/次。限制實驗：將模型組大鼠放入狹小空間，使得大鼠活動受限（大鼠不能轉身），又要保證大鼠不能受到擠壓，實驗環境昏暗，每晚一次，第1周60min/次，第2周120min/次，第3周180min/次。擁擠實驗：主要是將倍數的大鼠關入標準大鼠籠，造成擁擠應激。

3 身心疲勞造模（多重應激因素）

3.1 力竭游泳+剝奪睡眠

趙麗[26]采用睡眠剝奪聯合力竭游泳法建立慢性疲勞大鼠模型，以造成模型大鼠的心理與生理疲勞。睡眠剝奪時間為20h：實驗于每日固定時間將動物置于盒子內，并向內注入清水，剛沒過大鼠四肢（高2cm）。使大鼠能夠自由進食飲水，但卻無法入睡，于次日將動物放入塑料游泳池（水深50cm）25±1℃進行一次力竭游泳實驗，頭部沒入水中10s而未見浮出水面視為力竭，期間保證動物不被溺死，此聯合刺激持續3周。

3.2 冷水游泳+束縛應激

張文靜[27]采取冷水游泳聯合軀體束縛建立大鼠應激模型，每日上午將大鼠置于自制的水桶（高90cm、直徑60cm）內進行強迫游泳實驗，水深40～45cm，溫度15±2℃，觀察大鼠，當動物出現力竭而沉入水中時及時救出；下午進行大鼠軀體束縛實驗，將大鼠放入自制的束縛筒內，束縛時間1h，上述兩種應激實驗連續進行21天。楊啟昭[28]則采用單日進行束縛實驗，雙日進行冷水游泳實驗，兩種刺激持續交替進行14天，與上述研究略有區分。

3.3 冷水游泳+夾尾

陳傳偉[29]通過強迫冷水游泳聯合夾尾巴共同刺激建立動物疲勞模型。開始造模后,模型組大鼠在單數日期進行冷水有用實驗，雙數日期進行夾尾實驗（每次3min），每日進行軀體束縛實驗（束縛時間為20min），連續21天給予上述刺激。

3.4 束縛+力竭游泳+夾尾刺激

王娜娜[30]、葉雙雙[31]等的方法是將大鼠置于束縛筒中，每3天增加束縛時間，連續束縛21天。在束縛實驗期間交替聯合給予力竭游泳實驗和夾尾實驗進行刺激，單日采用夾尾激惹刺激，夾尾實驗的具體操作方法為：用夾子夾住大鼠尾部距離根部1～2cm的位置，以大鼠耐受且不脫落為標準。雙日采用力竭游泳，將大鼠置于游泳池（深45cm）內，溫度20±2℃，實驗過程中記錄大鼠自游泳開始至力竭狀態的時間，力竭以大鼠頭部下沉至水面下3s且未能自主回到水面且游泳動作異常為標準，每日實驗的時間均不同。

3.5 睡眠紊亂+力竭游泳+慢性束縛刺激

金小千[32]采用睡眠剝奪、力竭游泳聯合軀體束縛實驗建立大鼠CFS模型。睡眠剝奪實驗每日進行20h，于每日中午12:00開始。首先將飼養籠中的墊料清除，然后將籠內注入清水，水深以剛沒過大鼠頭部與四肢為標準，使大鼠無法進行正常睡眠，次日早8:00將大鼠取出。然后進行大鼠負重游泳實驗，負重重量為大鼠體質量的5%，游泳環境水深35cm、水溫21℃，5%負重游泳10天后，更換10%負重游泳，每次游泳時間20～25min，發現大鼠力竭后將大鼠救出。之后再繼續使用束縛袋進行軀體束縛實驗，使用鐵絲將袋口扎緊，靜置與實驗室地面2h，連續進行21天。

3.6 束縛+睡眠紊亂+擁擠+跑臺

張楊[33]通過聯合軀體束縛、睡眠紊亂、環境擁擠、跑臺運動等多因素應激源構建大鼠CFS模型。每日上午11點，強制大鼠進行炮臺運動，速度為20m/min，運動時間為1h；下午2點，將大鼠置于自制束縛筒，造成大鼠活動受限2h。大鼠進行束縛實驗及強制運動實驗的3h外，其余時間均飼養在35cm×25cm×15cm的擁擠飼養箱環境中，并接受定時噪音刺激。

3.7 束縛+跑臺+懸吊+游泳

尹喜玲的[14]CFS建模方法造模時間共12天。束縛聯合跑臺組：大鼠上午進行束縛刺激實驗，下午進行跑臺刺激訓練。為避免大鼠適應刺激，每3天增強1次實驗時間。跑臺實驗則先進行適應性訓練后，逐漸加入跑臺力竭性訓練，依次遞增跑速，直至大鼠力竭。懸吊游泳組：大鼠上午進行懸吊實驗，下午進行負重游泳實驗，連續12天。懸吊刺激實驗每3天加時1次，時間分別為1、1.5、2、2.5h。正式游泳實驗的前3天進行適應性訓練，游泳時間為30min，負重小鼠體質量的3%。

3.8 多種應激隨機組合

高春風[34]采用多刺激源聯合隨機組合建立應激疲勞模型，首先每天進行一次5%的負重力竭游泳實驗，然后采用隨機選取的多刺激因素方式進行刺激：包括禁食12h，禁水12h，光源干擾，夾尾1min，110dB超聲刺激持續1h，1mA、30V足底電擊5次，每隔1min刺激1次，30s/次。上述刺激源每天隨機選取兩種進行動物造模，防止老鼠適應性反應。同時Farhan H等[35]也采用多因素聯合刺激方法建立模型，使動物無法適應未來的刺激實驗，避免適應性反應造成的實驗影響，具體實驗方法為：連續10天給予大鼠不可預知的慢性溫和性刺激，期間在實驗的第1天、第6天將大鼠置于4℃的房間中50min，第2天、第7天將飼養籠傾斜并顛簸60min，第3天、第8天限制大鼠生存空間并限制其活動，第5天、第10天進行晝夜節律干擾3h。

4 模型檢驗

慢性應激動物模型若能夠有效、科學地代表CFS等疾病，一般應具有下列特點[36]：（1）行為表現的高度相似性，即動物模型在癥狀上與疾病癥狀的高度相似性；（2）造模方式所依據的理論與臨床慢性應激障礙或慢性疲勞的病因之間具有高度相關性；（3）動物模型的病理生理特征與臨床上接受CFS治療的患者具有高度相似性；（4）模型動物的行為學改變能夠持續足夠長的時間。由于在臨床上，CFS尚無特異性的檢測方法及特異性診斷指標，因此對于CFS的相關研究多采用觀察動物情緒及認知行為變化的一系列行為學檢測方法來判斷CFS動物模型成功與否，主要包括：鼠尾懸掛、十字迷宮及曠場測試等。當機體受到慢性應激刺激時，機體內環境穩態處于失衡狀態，可引起相關行為學的改變，也能夠由于應激狀態下引起一系列血生化及神經損害，引起大腦的器質性損傷，進而影響動物的情緒及認知功能（海馬受損會引起認知障礙），同時導致機體免疫力下降，引發疾病。

在模型檢驗方面，國內外研究在造模后多通過動物一般情況觀察和進一步的動物實驗了解動物體力情況，學習記憶情況、探究行為及情緒反應、糖水消耗實驗等行為學指標等[37-39]，來判斷動物造模是否成功；也有通過實驗室指標（白細胞、紅細胞、IgG、肝糖原、血清乳酸、血清尿素氮、血清CORT、ACTH）判斷者[36]。國外針對疲勞模型的檢測則更注重于一些行為學及生化指標的改變，比如在強制游泳實驗中動物的不動時間、活動能力、焦慮樣表現（高架十字迷宮和Mirror水迷宮）等直觀的行為學改變，同時也包括血脂質過氧化反應、過氧化氫酶、亞硝酸酯等生化指標變化來判斷是否成功建立了慢性應激性疲勞模型[40]。

5 總結

應激主要分為軀體和心理應激兩種類型，但在真實的應激狀態下，通常是兩種應激類型共同作用的結果，只能將其描述為以哪一種類型的應激為主要影響因素[41]。研究發現，大部分CFS單因素造模只能通過某一方面模擬慢性疲勞的狀態進行模型的構建。例如，單一的強制游泳法只能通過影響動物體力因素達到刺激效果而建立疲勞模型；慢性束縛模型則只能通過產生心理應激達到建模效果，均只能從某一方面模擬人類的疾病狀態。過度的運動訓練建立的疲勞模型只能從刺激軀體體力因素反映CFS的狀態，心理應激模型則主要通過免疫體液系統來揭示應激產生的機制[42]。

同樣地，CFS模型從刺激因素數量上又可分為單因素模型和復雜因素模型兩種類型：單因素模型涵蓋了強迫游泳、跑臺等刺激源建立軀體應激模型，束縛、電刺激、夾尾等應激源構建心理應激模型；復雜因素模型主要建立的是不規定時間、頻率的禁食、禁水、晝夜顛倒、夾尾、冰水游泳、束縛等慢性輕度不可預見性應激模型。各種建模方法各有優缺點，由于目前對于CFS的研究較少，且其發病機制及病理改變仍未明確，因此單一因素的動物模型很難模擬并完美地模擬慢性應激性疲勞的全部癥狀。近期的疲勞相關研究多采用多因素造模，通過構建兩種或多種復雜應激源刺激聯合對動物進行造模，同時兼顧了軀體應激和心理應激兩個因素。近年來，針對CFS的動物模型建立方法一直在不停地靠近疾病生理病理改變機制，為對于CFS的機制研究方向及抗疲勞治療方向均提供了可靠的實驗依據。但在未來的研究中，仍需要考慮動物模型的建立方法與疾病相關性、疾病臨床癥狀的模擬，從實驗方法手段技術的統一性、規范性方面進行深入探究。