Klotho在缺血性腦卒中患者血清中的表達及臨床意義

畢芳芳 史敏 蘇明權 程微微 張露

世界范圍內，每年有近1 500 萬人罹患卒中，近600 萬人死于該病，近50 萬人遺留終身殘疾，其已成為繼癡呆后致殘的第二位因素［1］。缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS），也稱腦栓塞，指由于腦的供血動脈狹窄或閉塞、供血不足導致的腦組織壞死的總稱。根據研究發現，缺血性腦卒中大約占臨床上卒中疾病總數的60%～80%，可反復發作，有一定的致殘率和致死率，而幸存者往往遺留不同程度的神經功能障礙，其突發性、嚴重性和不可預測性給患者和家屬帶來了嚴重的生理和心理負擔［2］。因此相關機制和治療策略的研究一直是神經科學領域的焦點。本研究前期研究顯示：氧化應激與炎癥過度反應可能是CIS 疾病進展中的重要因素之一［3］。近年有研究發現Klotho 水平的下降與炎癥反應，細胞死亡有關［4］。另有動物實驗證明，血清中Klotho水平的下降［5］。上述研究共同表明：Klotho在血清中起著至關重要的作用。但Klotho在CIS 患者中的具體表達及其與CIS 患者疾病活動度的關系，目前尚未見報道。本研究分析其與CIS 患者疾病活動度的相關性，為CIS 的診療及CIS 機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 CIS 患者標本的收集

選取2020年4月至2022年4月西安市西京醫院收治的52 例CIS 患者作為研究對象。納入標準：①年齡60～85 歲；②確診為缺血性腦卒中；③自愿受試。排除標準：①出血性腦卒中；②精神病；③依從性差。所有患者及其家屬均對本研究充分知情，并已經簽署知情同意書，本研究經西安培華學院醫學院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

RNA 提取試劑盒（DP400，天根，西安）；GAPDH抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國），Klotho 抗體（Sigma-Aldrich，美國）。Viia 7 實時定量PCR 儀（ABI Viia 7，美國）。Klotho 及內參引物均由上海生工生物公司合成；Klotho上游引物：5′-TAGCC AGCGA CAGCT ACAAC-3′，下游引物：5′-GAAGC GGTAG TGAGT GACCC-3′，GAPDH 上游引物：5′-CTCTG CTCCT CCTGT TCGAC-3′，GAPDH下游引物：5′-TAGCC TCCCG GGTTT CTCTC-3′。

1.3 RT-qPCR

根據說明書提取總的RNA，并檢測其濃度和純度，RNA 純度A260/280 在1.8～2.1 之間認為合格。逆轉錄條件：5℃10 min，50℃30 min，85℃5 min。qPCR 反應：預變性95℃，5 min；循環反應95℃，5 s，58℃，30 s，72℃，30 s，循環次數，35；徹底延伸：72℃10 min。每個樣本3 個復孔。采用2-ΔΔCt法計算Klotho 的相對表達量。

1.4 Western Blotting

提取組織總蛋白，按照BCA 蛋白測定試劑盒說明書進行濃度檢測，分裝后保存于-80℃冰箱備用。按照所測蛋白濃度，計算含40 μg 蛋白的體積即為上樣量，99℃加熱5 min 后冷卻上樣；60 V 等壓電泳50 min 后轉為110 V 繼續電泳1.5 h 至溴酚蘭到達分離膠的底部；電泳結束后，取出凝膠，放置在1×Transfer buffer 中平衡15 min。按照白板-濾紙-PVDF 膜（使用前在甲醇中活化5 min）-凝膠-濾紙-黑板的順序置于夾子中，加入預冷的1×Transfer buffer，100 V、90 min；轉完膜后，將PVDF膜取出，放在5%脫脂牛奶中封閉2 h，用1×TBST洗滌一次；將目的條帶，放在相應的一抗抗體（使用前按照說明書推薦比例用1×TBST 稀釋）中4℃搖床孵育過夜。第二天，目的條帶在1×TBST 中洗3 次，每次10 min，再放入相應的二抗抗體中（使用前按照說明書推薦比例用5%脫脂牛奶稀釋），常溫搖床孵育1 h，再在1×TBST 中洗3 次，每次10 min；最后化學發光、顯影。結果分析：FluorchemTM8900圖像分析軟件定量分析靶蛋白及內參GAPDH條帶的含量，求其比值進行統計分析。

1.5 統計學分析

采用SPSS 16.0 統計軟件進行分析；計量資料用（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；用非參數相關的Spearman 軼相關系數（r）分析評估兩個變量之間的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Klotho 的mRNA 表達結果

Klotho的mRNA 水平在CIS 患者血清標本中的相對表達量為（1.83±0.23），低于正常對照組（3.34±0.56），差異有統計學意義（t=17.986，P＜0.05）。見圖1。

圖1 Klotho mRNA 在CIS 患者及正常對照組表達Figure 1 mRNA Expression of Klotho in CIS patients and the normal controls

2.2 Klotho 的蛋白表達結果

Klotho的蛋白水平在CIS患者血清標本中的表達量為（141.78±69.04），低于正常對照組（375.82±83.71），差異有統計學意義（t=15.554，P＜0.05）。見圖2。

圖2 Klotho 蛋白在CIS 患者及正常對照組表達Figure 2 Protein Expression of Klotho in CIS patients and the normal controls

2.3 Klotho 的表達與CIS 患者疾病活動度的相關性分析

CIS 患者血清樣本中Klotho的表達與其疾病活動度評估指標NIHSS 評分及Barthel 指數（BI）評分具有一定的相關性。見圖3。

圖3 Klotho 的表達與CIS 患者疾病活動度的相關性分析Figure 3 Correlation analysis between the expression of Klotho and disease activity in patients with CIS

3 討論

CIS 也稱腦栓塞，是腦動脈狹窄或阻塞、腦供血不足導致的腦組織壞死的腦缺血類型的總稱，為臨床常見的腦血管疾病之一［1］。腦缺血性損傷的機制涉及許多病理生理過程，越來越多的研究認為，其發病原因與炎癥、氧化應激、細胞凋亡、細胞焦亡等均有一定的相關性［6］。其中，炎癥級聯反應所導致的細胞凋亡和焦亡是CIS 發病的核心環節。因此，抑制機體內源性炎癥級聯反應是CIS 治療的關鍵所在。流行病學研究顯示：CIS 在中國仍呈逐年增高的趨勢［7-8］，己成為神經科學研究的熱點和難點之一。因此，進一步闡明CIS 發病相關機制和治療策略，是一項十分重要且扼待解決的任務，具有重要的臨床價值及意義。

在生命發育與健康維持過程中，Klotho基因通過調控離子通道、Wnt等多個信號通路和靶基因的表達發揮抗衰老、腎臟保護、心血管保護、抗腫瘤和調節代謝等作用［9-10］。Klotho基因是Kuro-o 等科學者在1997年研究自發性高血壓時偶然發現的［13］，后來研究發現Klotho基因缺失鼠（Kl-/-）的表型類似人類的衰老表現，包括壽命縮短、動脈硬化、皮膚肌肉萎縮、認知障礙、運動神經元受損、軟組織鈣化、聽力下降、骨質疏松等。然而，當Klotho蛋白過表達時，實驗動物的壽命可得以延長，表明了它是一個衰老抑制基因；當Klotho蛋白表達異常時，會出現一系列與衰老及與衰老密切相關的疾病，提示Klotho基因在衰老和衰老相關疾病的發生中起著重要作用。Klotho基因首先從表現為衰老的模型小鼠中克隆成功［11］。隨后發現人和大鼠中也存在Klotho基因，且它們之間具有較高的同源性（83%）。Klotho基因全長50 kb，包含5 個外顯子和4 個內含子，在人和小鼠中均定位于第13 號染色體（13q12）。在其基因結構中，其RNA 可通過選擇性拼接產生兩種蛋白產物，一種為包括5 個外顯子和4 個內含子，編碼形成的膜型Klotho蛋白；一種為僅含3 個外顯子和2 個內含子而編碼形成的分泌型Klotho蛋白，分泌型的還有一種是直接從膜型Klotho蛋白的胞外域脫離下來的。人的分泌型Klotho蛋白全長有549 個氨基酸殘基（小鼠為550個），該類型缺乏跨膜結構和胞內結構，在人的大腦、海馬、胎盤、腎臟、前列腺和小腸等組織中均檢測到其存在，在血清中也檢測到Klotho蛋白的存在［12］。分泌型Klotho可通過中斷細胞內控制氧化應激、纖維增生、炎癥、細胞衰老等局部或全身性病理過程的關鍵細胞信號分子起到保護作用。研究表明，Klotho可靶向腎小管細胞中的線粒體功能障礙和細胞衰老來延緩腎纖維，且進一步研究發現Klotho是通過抑制胰島素下游IRS-1/PI3K/AKT 信號通路從而緩解腎臟的纖維化［13］；此外，也有研究報道Klotho是通過抑制細胞壞死和氧化應激從而減輕血管緊張素II 引起的心臟毒性；對于中風的研究，有研究報道Klotho在血清中的濃度可預測急性缺血性中風患者三個月后的功能結局［14］，進一步有研究發現Klotho協助FGF21受體FGFR1通過激活PI3K/Akt信號通路來促進對于新生鼠缺氧缺血性腦損傷后的功能恢復［15］；四川大學華西藥學院研究團隊發現Klotho 增加了腦內錳超氧化物歧化酶（Mn-containing superoxide dismutase，Mn-SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的表達，減少了腦內丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，同時Klotho 過表達抑制了Akt 和FoxO1 的磷酸化［15］，研究提示Klotho 可能通過Akt/FoxO1 信號通路在CIS 的發生發展中發揮著重要的作用，但具體的作用機制仍然需要進一步探究。以上結果均強烈提示，Klotho很可能在CIS 的發生發展中起到重要的作用。

本研究提示Klotho 可能在CIS 的發病中扮演著十分重要的角色，為CIS 發病機制的相關研究提供了新的方向和靶點。但Klotho 在CIS 發病中的具體的作用機制仍然需要進一步的研究。