腎透明細胞癌患者鐵死亡相關基因的預后作用

李艷，桂子瑋，李希捷，王勇琦，牛曉辰

(1.山西醫科大學第二臨床醫學院，太原 030001;2.山西醫科大學基礎醫學院，太原 030001;3.山西醫科大學第五臨床醫學院，太原 030012)

腎細胞癌(RCC)是起源于腎小管上皮系統的惡性腫瘤，發病率居泌尿系統惡性腫瘤第二位，且并發癥發生率每年呈上升趨勢[1]。腎透明細胞癌(Kidney renal clear cell carcinoma, KIRC)是最常見的腎細胞癌，其病因復雜多樣，與遺傳、吸煙、肥胖、高血壓及抗高血壓治療等有關[2]。KIRC早期癥狀不典型，大多數患者就診時已是晚期，晚期患者放化療療效差，免疫治療和免疫聯合靶向治療是發展的新趨勢，然而仍存在諸多弊端，如費用昂貴、脫靶效應等[3-4]。由于KIRC的病因復雜，腫瘤組織高度異質性等，患者的治療效果仍不理想，因此急需尋找新的標志物，用于指導KIRC的治療。

鐵死亡是一種新的程序性細胞死亡方式，其特征在于鐵依賴性的脂質過氧化物(LOS)積累使氧化還原反應平衡被破壞，最終導致細胞死亡[5]。近年來，鐵死亡與腫瘤之間的關系受到了廣泛關注。研究表明GPX4是鐵死亡發生過程中的關鍵調節器[6]，一方面，通過抑制胱氨酸/谷氨酸逆轉運蛋白體(System xc-)會引起谷胱甘肽(GSH)耗竭，進而使谷胱甘肽過氧化物酶 4(Glutathione peroxidase 4，GPX4)失活；另一方面，鐵死亡誘導劑可以直接抑制 GPX4 的活性。通過以上途徑使GPX4失活，導致LOS的積累進而引發鐵死亡的發生。越來越多的研究證實，肝細胞癌[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9]等對鐵死亡敏感，但針對KIRC的相關研究較少。

由于鐵死亡與腫瘤的關系受到許多鐵死亡相關基因(Ferroptosis-related genes, FRGs)的調控，腫瘤組織中FRGs的表達可以用來評估患者的預后，例如，在肝細胞癌中，研成功構建相關預后模型，靶向FRGs可能是治療肝細胞癌的一種選擇[10]。本研究通過分析TCGA數據庫，獲得KIRC的基因表達信息，進而分析樣本中FRGs的差異表達，從而構建包含多個FRGs的模型去有效預測KIRC患者的生存情況，并通過分析風險評分模型與免疫狀態之間的相關性，探討潛在機制，為臨床治療提供診療依據以及尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 數據下載與處理

通過TCGA數據庫(The Cancer Genome Atlas, https://portal.gdc.cancer.gov/)下載KIRC患者的mRNA表達譜數據，該數據集包括539例KIRC患者的腫瘤組織測序信息和72例正常組織測序信息，并利用R語言(R 3.6.3, https://www.r-project.org/)對數據進行提取和標準化處理。通過文獻檢索獲得60個與鐵死亡相關基因的信息[10]，將表達矩陣中的基因信息與鐵死亡相關基因取交集，獲得新的鐵死亡相關基因表達矩陣。由于TCGA數據庫屬于公開獲取資源，本研究免于倫理委員會的批準。

1.2 鐵死亡相關基因差異分析

使用R語言的“limma”包來識別腫瘤組織與正常組織中差異表達的FRGs，設置過濾條件：FDR(BH)矯正后的閾值P.adj<0.05，對數差異表達倍數變化絕對值|log2FC|>1。

1.3 預后風險評分模型構建

利用perl語言(perl 5.32.0, https://www.perl.org/)將鐵死亡相關基因表達量與生存時間進行合并，刪除臨床信息不完整以及生存時間<30 d的樣本。利用“survival”包進行單變量Cox回歸分析，篩選出具有預后價值的鐵死亡相關基因；將具備預后價值的鐵死亡相關基因同差異表達的鐵死亡相關基因取交集，為防止過度擬合，利用lasso回歸分析篩選掉相關性高的基因；之后進行多變量Cox回歸分析，得到風險基因，構建預測生存時間的風險評分模型，并輸出納入模型基因的風險評分系數(Coef)。所構建的預后風險評分模型計算公式為：風險值(Risk score)=風險基因表達量 1×coef 1+風險基因表達量 2×coef 2+...+風險基因表達量n×coefn。

1.4 預后風險評分模型評價

根據風險評分模型公式，計算513例患者的風險值，根據中位數值將患者分為低風險組和高風險組。運用Kaplan-Meier(K-M)法進行生存分析，明確風險值和生存時間之間的關系；采用時間依賴的偏移工作特征曲線(ROC)進行模型預測效果的評價；繪制高低風險組的風險曲線和生存狀態圖。利用單因素和多因素獨立預后分析評估各個變量及風險值與預后之間的關系，判斷風險模型能否作為獨立預后指標。此外，利用“prcomp”包功能進行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)，還進行了t-SNE測驗，將分組可視化，從而探索不同群體的分布情況。

1.5 高低風險組功能富集分析

根據鐵死亡相關預后模型將患者分為高低風險兩組，利用“limma”包對兩組進行基因的差異表達分析，以此探究高低表達組之間生存差異的可能原因，設置過濾條件：FDR(BH)矯正后的閾值P.adj<0.05，對數差異表達倍數變化絕對值|log2FC|>2。利用“clusterProfiler”“enrichplot”以及“ggplot2”三個包對差異基因進行GO(Gene Ontology)功能注釋和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway, KEGG pathway)通路富集分析，設置P.adj<0.05，Q.adj<0.05，并繪制富集氣泡圖與條形圖。

1.6 高低風險組免疫浸潤模式分析

利用“gsva”包進行ssGSEA(Single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)分析16種免疫細胞浸潤分數和13種免疫通路的活性。

2 結果分析

2.1 鐵死亡相關基因差異分析

對539例KIRC患者的腫瘤組織測序信息和72例正常組織測序信息進行鐵死亡相關基因的差異分析，共得到21個差異基因(見圖1)，差異信息(見表1)。

表1 差異表達的鐵死亡相關基因

圖1 差異表達的鐵死亡相關基因

2.2 預后模型構建

采用單因素Cox回歸模型對鐵死亡相關基因進行分析，獲得28個與KIRC預后相關的基因(見圖2a)。將預后相關基因與差異的鐵死亡相關基因取交集，共得到12個基因繪制Venn圖(見圖2b)。根據單因素Cox回歸分析結果，進行Lasso回歸與多因素Cox回歸分析，結果顯示有10個基因被納入模型(見圖2c、2d)。基于最佳λ值，構建出鐵死亡相關基因的預后風險評分模型：風險值(Risk score)=(0.024 5)×ALOX5表達值+(0.126 0)×CBS表達值+(0.199 5)×CD44表達值+(0.218 3)×CHAC1表達值+(-0.295 9)×HMGCR表達值+(0.036 7)×MT1G表達值+(0.061 4)×SLC7A11表達值+(-0.080 7)×FDFT1表達值+(0.160 3)×PEBP1表達值+(-0.220 5)×GOT1表達值。

圖2 鐵死亡相關基因差異分析

ROC曲線分析(見圖3b)，顯示1年曲線下面積(AUC)為0.739，2年為0.717，3年為0.713，均大于0.7，表明用上述模型預測KIRC患者預后的準確性高。K-M生存分析顯示，高風險組與低風險組的生存有統計學意義(P=5.73×10-13)，隨著時間的推移，生存率逐年下降，其中高風險組生存率顯著低于低風險組(見圖3c)。PCA和SNE分析顯示，不同的風險組分布在兩個方向上，表明10個基因的預后風險評分模型可以將高低風險組很好的區分開(見圖3d、3e)。

2.3 預后風險評分模型評價

計算患者的風險值，將其從低到高排序后依據中位值，分為高風險組和風險組。其中，高風險組有256例，低風險組有257例。生存狀態圖表明，高風險組死亡病例數比低風險組高，高風險組中總體生存率較短的患者多于低風險組，高風險組的ALOX5、CBS、CD44、CHAC1、HMGCR、MT1G、SLC7A11、FDFT1、PEBP1、GOT1表達量均高于低風險組(見圖3a)。

圖3 預后風險評分模型評價

2.4 預后風險評分模型的獨立預后價值

為評價預后風險評分模型是否能做為獨立預后預測因子，進行單變量和多變量Cox回歸分析，在單因素Cox回歸分析顯示年齡、grade分級、stage分期、T分期、M分期、N分期和風險評分與KIRC患者的OS顯著相關(見圖4a)，其中風險評分的HR值為2.848，95%置信區間為2.124-3.819。在多因素Cox回歸分析中，年齡、風險評分與KIRC患者的OS顯著相關(見圖4b)，其中風險評分的HR值為2.173，95%置信區間為1.506-3.135。所以，風險評分可以作為評價KIRC患者的獨立預后因素。

圖4 單因素和多因素Cox回歸分析結果

2.5 高低風險組功能富集分析

將差異表達的鐵死亡相關基因進行富集分析，得到62個生物過程(BP)、5個細胞成分(CC)、4個分子功能(MF)。GO BP顯示差異基因顯著富集于經典途徑的補體激活、免疫球蛋白介導的免疫應答、B細胞介導的免疫應答等免疫方面。GO CC顯著富集于免疫球蛋白復合物、質膜、細胞外基質等方面。GO MF顯著富集到抗原結合、免疫球蛋白結合等方面(見圖5a)。通過KEGG富集分析顯示，差異表達的基因主要富集在IL-17信號通路上(見圖5b)。

圖5 GO和KEGG分析的代表性結果

2.6 高低風險組免疫浸潤模式分析

為進一步探索預后風險評分模型與免疫狀態之間的相關性，使用ssGSEA量化了不同免疫細胞亞群、細胞功能、途徑等，結果顯示大部分免疫細胞的評分在高風險組和低風險組之間表現出顯著差異(見圖6a、6b)，包括aDCs、巨噬細胞、Th1細胞、Th2細胞等。高風險組巨噬細胞、CD8+T細胞、APC共刺激等評分較高，而aDCs、Th1細胞、Th2細胞、T細胞共刺激等評分較低。表明高風險組抗原提呈過程較強，而細胞免疫、體液免疫等過程減弱。因此，高危患者抗腫瘤免疫減弱可能是其預后不良的一個原因。

圖6 不同風險組間ssGSEA評分比較

3 討 論

鐵死亡是一種全新的細胞程序性死亡，本質是鐵離子依賴的脂質過氧化產物超量蓄積引起的以線粒體改變為主的氧化損傷，其存在于多種疾病的病理生理過程中，研究發現誘導細胞鐵死亡可以殺滅腫瘤細胞進而抑制腫瘤的生長[11]。

通過基因差異表達分析得到28個與KIRC患者預后相關的基因，根據單因素CoX回歸分析、Lasso回歸分析最終篩選得到10個與患者預后相關的基因(ALOX5、CBS、CD44、CHAC1、HMGCR、MT1G、SLC7A11、FDFT1、PEBP1、GOT1)，并以此為基準構建預后風險評分模型。

預后模型所用到的基因大致分為四類：脂質代謝(PEBP1、FDFT1、HMGCR、ALOX5)，抗氧化代謝(SLC7A11、CBS)，能量代謝(GOT1)和其他(CD44、CHAC1、MT1G)[12]。ALOX5(花生四烯酸5-脂氧合酶)基因編碼脂氧合酶，它是催化花生四烯酸轉化為白三烯的關鍵酶，主要在白細胞中表達。研究表明該基因及其產物出現在包括乳腺癌、前列腺癌在內的多種癌癥中，其代謝物在腫瘤細胞增殖、抑制凋亡以及轉移中具有調節作用[13]。標準培養條件下的前列腺癌細胞不斷生成ALOX5的代謝產物，阻斷這些代謝產物活性可導致癌細胞凋亡[14]；而ALOX5基因多態性于肺癌風險增加相關[15]。

HMGCR(3羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶)基因、FDFT1(維生素K2二磷酸法呢酰轉移酶1)基因參與膽固醇的合成代謝，是調控脂代謝的重要基因。HMGCR在多種癌癥中都有表達，在膠質瘤組織中通過激活YAP的轉錄活性增強膠質瘤細胞的成瘤性，而胃癌組織中則通過激活hedgehog/Gli1信號促進胃癌細胞的生長、遷移，下調該基因表達則可抑制癌細胞的生長、遷移甚至避免腫瘤的發生[16]。CBS(胱硫醚-β合成酶)基因參與同型半胱氨酸轉硫途徑的第一步反應，將同型半胱氨酸(Hcy)不可逆轉化為半胱氨酸和α-酮丁酸，其催化作用需要維生素B6參與。胱硫醚-β-合成酶活性降低將引起高同型半胱氨酸血癥，進而導致多器官組織損傷。轉硫途徑不僅移除了體內過多的Hcy，而且對體內氧化還原平衡有重要的維持作用。研究表明，正常結腸黏膜和增生性結腸息肉中CBS表達相對較低，腫瘤組織中高表達的CBS通過H2S依賴性調節癌細胞生長、增殖和遷移[17]。

近幾年來，隨著細胞鐵死亡與腫瘤研究熱點的興起，免疫浸潤相關分析作為預后指標的研究也逐漸進入人們的視野。基于不同風險組之間的差異，我們進行了富集分析，意外地發現許多免疫相關的生物過程和途徑得到了豐富。推測鐵死亡可能與腫瘤免疫有密切聯系是合理的。為了進一步探索風險評分模型與免疫狀態的相關性，我們量化了不同的免疫細胞亞群、細胞功能及途徑等得出：高風險組巨噬細胞、CD8+T細胞、APC共刺激等比例較高，而aDCs、Th1細胞、Th2細胞、T細胞共刺激等比例較低。表明高風險組抗原提呈過程較強，而細胞免疫、體液免疫等過程減弱。較高的風險評分與抗腫瘤免疫損傷有關，因此，高危患者抗腫瘤免疫減弱可能是其預后不良的一個原因。

4 結 論

以腫瘤與細胞鐵死亡間的相關性為前提，篩選到10個與患者預后顯著相關的基因并以此構建風險評分模型，為KIRC患者的預后提供了新思路、新方法，具有一定的新穎性；本研究所得到的基因可以作為KIRC基礎研究與治療的可靠靶點，有一定的應用價值；不足之處在于，沒有對所得到的模型進行驗證，從而提高評分模型的可靠性；沒有進行動物、細胞水平進行功能驗證，缺乏大規模多中心的臨床試驗進行檢驗。